Изучал греческую и римскую археологию в университетах Лейпцига (1829—1830), Гёттингена (1830—1832) и Берлина (1832—1833). Получив докторскую степень за диссертацию De tabulis Eugubinis в 1833, отправился в Париж, где посещал лекции историка античности Жана Летронна, а также Шампольона. Увлёкся египетской иероглификой, осматривал коллекции египетских древностей в разных странах Европы, изучал литографию и гравировку.
После смерти Шампольона Лепсиус занялся систематическим изучением его фундаментального труда Grammaire ?gyptienne, который был опубликован посмертно в 1836, но не сразу получил широкое признание. В 1836 Лепсиус отправился в Тоскану, где встретился с Иполито Росселлини, который путешествовал в Египет вместе с Шампольоном в 1828—1829. В ряде писем к Росселлини Лепсиус развил идеи Шампольона об алфавитном значении ряда египетских иероглифов, указав при этом на то, что гласные на письме не отображались.
Лепсиус считается отцом современной египтологии. Он также внёс немалый вклад в изучение других африканских языков, хотя его взгляды на африканское языкознание уже при жизни были несколько устаревшими. Лепсиус изобрёл «Стандартный алфавит Лепсиуса» для транслитерации африканских языков (1855, пересмотрен в 1863 г.). В 1880 выпустил грамматику нубийского языка.