Наиболее известен как путешественник-ботаник, посетивший многие местности Северной Америки.
Родился в семье французского купца, мать его была немкой. После смерти отца в 1793 вдова с детьми долгое время жила в Марселе, а затем на Сицилии. Рафинеск получил приличное домашнее образование, главной его привязанностью была ботаника.
Переселившись в 1802 из Сицилии в Северную Америку, поступил на службу в торговый дом братьев Клиффорд в Филадельфии.
В 1805 он вновь появился на Сицилии, где открыл собственное успешное дело. Бывая часто на рынке в Палермо, он прикупил довольно большое количество редких раковин моллюсков (некоторые из них описаны Рафинеском впервые).
Корабль, на котором он возвращался в 1815 в США, потерпел крушение у берегов Коннектикута: все его рукописи, коллекции и книги погибли. Рафинеск остался нищ, его жена бросила его, сын — которого он назвал Карлом Линнеем — умер. У него только и осталось, что путешествовать и писать. Что он и делал.
Рафинеск разработал собственную систему классификации живых организмов.
Совершив множество научных экспедиций по Северной Америке, Рафинеск открыл и описал (по его собственным словам) не менее 250 видов растений и животных.
Был профессором естественной истории в Лексингстонском университете (Кентукки) и в институте Франклина в Филадельфии.
В 1832—1833 Рафинеск выдвинул предположение, что комбинации точек и линий в письменности майя представляют собой цифры, и настоял на необходимости изучения современных майяских языков для понимания древней письменности.
Род растений Рафинеския (Rafinesquia Nutt.) из семейства Астровые (Asteraceae) назван в его честь.