Родители Бернстайна (Самуэль Джозеф Бернстайн и Дженни Резник) — выходцы из Ровно, евреи. Бернстайн изучал композицию в Гарвардском университете у Уолтера Пистона, затем учился в Кёртисовском институте музыки у Фрица Рейнера (дирижирование), Рэндалла Томпсона (оркестровка), Рихарда Штёра (контрапункт) и Изабеллы Венгеровой (фортепиано); позднее занимался также под руководством Сергея Кусевицкого.
Ассистент дирижёра (1943-44), дирижёр (1957-58), главный дирижёр (1958-69) Нью-Йоркского филармонического оркестра (где стал преемником Бруно Вальтера) и городского оркестра «Нью-Йорк сити симфони» (1945-48). Умер от сердечного приступа.
Обладатель Премии Сименса (1987). Автор книг «Радость музыки» (The Joy of Music, 1959) и «Бесконечное разнообразие музыки» (The Infinite Variety of Music, 1966), «Концерты для молодежи» (Young People’s Concerts), «Вопрос без ответа» (The Unanswered Question, 1976), «Открытия» (Findings, 1982).
В 1971 году он был введён в национальный Зал славы композиторов. Похоронен на кладбище Грин-Вуд в Нью-Йорке.
Осуществил премьеру симфонии «Турангалилы» Оливье Мессиана (не записана).
Бернстайн дважды записывал полные циклы симфоний Бетховена (для Sony и Deutsche Grammophon соответственно), участвовал в записи цикла фортепианных концертов Бетховена с Кристианом Циммерманом. Бернстайн — единственный дирижер, дважды осуществивший запись полного цикла симфоний Густава Малера (для Sony и Deutsche Grammophon соответственно). Записал также полный цикл симфоний Петра Чайковского, многочисленные сочинения американских композиторов, произведения Карла Нильсена, Дариюса Мийо. Из музыки добетховенского времени выделяются записи произведений Йозефа Гайдна.
По результатам опроса, проведённого в ноябре 2010 года британским журналом о классической музыке BBC Music Magazine среди ста дирижёров из разных стран, среди которых такие музыканты, как Колин Дэвис (Великобритания), Валерий Гергиев (Россия), Густаво Дудамель (Венесуэла), Марис Янсонс (Латвия), Леонард Бернстайн занял второе место в списке из двадцати наиболее выдающихся дирижёров всех времён.