В 1931 году стал одним из основателей театрального коллектива Group Theatre. В 1949 году начал работать в школе актёрского мастерства Actors Studio в Нью-Йорке. В 1952 году стал её руководителем, обучение вёл по своей методике на основе системы Станиславского. Среди выпускников школы много известных актёров — Пол Ньюман, Аль Пачино, Мэрилин Монро, Джейн Фонда, Дастин Хоффман, Роберт де Ниро, Марлон Брандо, Микки Рурк.
В 1966 году основал Actors Studio West в Лос-Анджелесе. В 1969 году основал Театральный институт Ли Страсберга. В 1974 году сыграл роль второго плана в фильме «Крёстный отец-2». За эту роль Страсберг номинировался на кинопремии «Оскар» и «Золотой глобус».
Первая жена — Нора (Nora Krecaun), 1926—1929 годы. В 1934—1966 годах был женат на актрисе Поле Страсберг. Их дети — актриса Сьюзан Страсберг и преподаватель актёрского искусства Джон Страсберг. Третья жена — Анна Мизрахи. Дети — Давид и Адам. Был близким другом своей ученицы Мэрилин Монро, которая завещала ему большую часть своего состояния.