Лазарь Маркович (при рождении Лейзер Мордхович) Заменгоф родился в городе Белостоке Гродненской губернии Российской империи, первым ребёнком в семье преподавателя реального училища Марка Фабиановича Заменгофа и Розалии Шолемовны Заменгоф. Марк Фабианович Заменгоф публиковал в газете «Гацефира» работы по филологии древнееврейского языка, составил учебные пособия на иврите по еврейскому вероучению, географии и языкознанию. Родители поженились в 1858 году, за год до рождения сына. Позже в семье родились ещё пятеро сыновей (Феликс, Герш, Генрик, Леон и Александр) и пятеро дочерей (Фейгл (Фаня), Гитл, Сура-Двойра, Мина и Ида). Разговорными языками в семье были идиш и русский. В 1873 году семья переехала в Варшаву. В августе 1874 года Заменгоф поступил в четвёртый класс 2-й мужской гимназии.
Хотя большинство населения Белостока составляли говорящие на идише евреи, в нём также проживали поляки, немцы и белорусы. Межэтнические отношения в городе были достаточно напряжёнными, и это расстраивало молодого Людвика. Он полагал, что главная причина ненависти и предрассудков лежала во взаимном непонимании, вызванном отсутствием одного общего языка, который играл бы роль нейтрального средства общения между людьми, принадлежащими к разным народам и говорящими на разных языках.
Ещё в гимназии в Варшаве Заменгоф предпринял попытки создать международный язык с очень богатой, но также очень сложной грамматикой. Когда он изучил английский (уже после немецкого, французского, латыни и греческого), он решил, что международный язык должен иметь сравнительно простую грамматику с широким использованием суффиксов и префиксов для образования производных слов.
К 1878 году его проект «Lingwe uniwersala» был практически завершён. 17 декабря Заменгоф с гимназическими друзьями отпраздновал создание языка. Однако Заменгоф в то время был слишком молод, чтобы опубликовать свою работу. Вскоре после окончания гимназии он начал изучать медицину в Москве, а затем в Варшаве. В 1885 году Заменгоф окончил университет и занялся медицинской практикой в качестве окулиста в местечке Вейсеяй (Сувалкского уезда), где жила семья его сестры Фейгл (Фани) Пиковер, с 1886 года — в Плоцке (ныне в Польше). Работая врачом, он продолжал совершенствовать проект международного языка.
В течение двух лет он пытался собрать средства на публикацию книги с описанием своего международного языка, пока не получил финансовую помощь от своего будущего тестя Александра Зильберника. В 1887 году книга под названием «Д-ръ Эсперанто. Международный языкъ. Предисловіе и полный учебникъ» («D-ro Esperanto. Lingvo internacia. Anta?parolo kaj plena lernolibro») была опубликована на русском языке. За русским учебником последовали издания на польском, французском и немецком. Среди эсперантистов этот учебник известен как Первая книга (Unua libro).
Для Заменгофа этот язык был не просто средством общения, но и способом распространения идей. Он хотел проповедовать идею мирного сосуществования различных народов и культур. Заменгоф даже разработал учение «Homaranismo» (Гомаранизм), чтобы распространять эти идеи.
Заменгоф был первым переводчиком художественной литературы с естественных языков на эсперанто и первым поэтом на эсперанто, «ещё в колыбели обручившим эсперанто с поэзией». Его стихи проникнуты идеями братства народов и религиозностью.
Заменгоф стал неформальным лидером нового эсперанто-движения, хотя он никогда не стремился к славе или власти. Эсперантисты называли его Маэстро, но сам Заменгоф не любил этот титул и отказался занять какой-либо официальный пост внутри эсперанто-движения. С 1895 года он отошёл от связанной с эсперанто деятельности, к которой вернулся только в 1902 году, отчасти в связи с контрактом на издание книг на эсперанто, подписанным с французским издательством «Ашет» (Hachette).
29 июля 1905 года во Франции Заменгоф был награждён Орденом Почётного легиона. В том же году 5—12 августа он участвовал в первом Всемирном конгрессе эсперанто в городе Булонь-сюр-Мер. Он участвовал в работе всех Всемирных конгрессов, но в 1914 году поезд, в котором супруги Заменгоф ехали на Всемирный конгресс эсперанто в Париже, остановили под Кёльном в Германии. Началась Первая мировая война. Российским участникам пришлось возвращаться на родину кружным путём через нейтральные страны. Тяжёлым ударом для Заменгофа стала гибель на фронте его младшего брата Александра 18 июля 1916 года.
Заменгоф скончался 14 апреля 1917 года в оккупированной германскими войсками Варшаве и был похоронен 16 апреля на варшавском еврейском кладбище.
В 1879 году, будучи студентом Московского университета, Л. Заменгоф под псевдонимом «Л. Гамзефон» написал первую на русском языке грамматику идиша, которую он частично опубликовал в виленском журнале «Лэбн ун висншафт» (Жизнь и наука) в 1909 году на идише. Полностью исходный русский текст с параллельным переводом на эсперанто был опубликован лишь в 1982 году в переводе Адольфа Холцхауза (Adolf Holzhaus) в «L. Zamennhof, provo de gramatiko de novjuda lingvo» (Попытка грамматики новоеврейского языка, Хельсинки, 1982; стр. 9—36). В этой работе, помимо описания собственно грамматики, Заменгоф предложил перевести идиш с еврейского письма на латинское, а также провести общую реформу орфографии еврейского языка. В тот же период Заменгоф написал и другие филологические работы на идише, в частности, первую классификацию новой еврейской поэтики.