Была воспитана при французском дворе, поскольку по договору 1482 года предназначалась в жёны Карлу VIII, однако после его помолвки с Анной Бретонской возвратилась в 1493 году к своему отцу.
Сохранился её портрет кисти Муленского мастера, придворного живописца герцогов Бурбонских.
Была выдана замуж за инфанта Хуана, сына Изабеллы Кастильской и Фердинанда II Арагонского. Но через 6 месяцев её муж, наследник испанской короны скончался. Маргарита в момент смерти мужа была на 6-м месяце беременности. Ребёнок родился мёртвым. Таким образом, права инфанта Хуана на наследования перешли к сестре, будущей Хуане Безумной.
В 1501 году она вышла замуж за Филибера II, герцога Савойского, который скончался через три года. Этот брак был бездетным. В 1507—1515 годах Маргарита была правителем габсбургских Нидерландов, воспитателем и единственной «матерью» своего племянника, будущего императора Карла V и его любимой сестры — Элеоноры.
Маргарита выступала как посредник между своим отцом и его подданными в Нидерландах, способствовала торговому миру с Англией, заинтересованной в фламандской торговле, и играла роль в формировании Камбрейской лиги (1508).
После своего совершеннолетия в 1515 году Карл стал сопротивляться её влиянию. Но вскоре понял, что тётка Маргарита является одним из его наиболее мудрых советников, и снова сделал её правительницей Нидерландов после паузы в 4 года (1519-30). На этой должности она оставалась до самой своей смерти.
В 1529 году совместно с Луизой Савойской она способствовала Камбрейскому миру, т. н. Paix des Dames.
Маргарита скончалась в Мехелене, между Антверпеном и Брюсселем, в месте, где находилась её главная нидерландская резиденция. Своим единственным наследником она назвала племянника Карла V. Погребена в во французском городе Бурк-ан-Бресе, где после смерти второго мужа основала монастырь в память о нём.
Рядом с Мехеленским собором стоит её статуя. Время правления Маргариты было периодом мира и процветания для Нидерландов, несмотря на то, что протестантская Реформация начинала набирать обороты, особенно на севере страны. Первые протестантские мученики были сожжены между 1524—1525 годами.
Маргарита имела некоторые проблемы с тем, чтобы держать под контролем Карла, герцога Гелдерна. Она смогла заставить его подписать мирный договор в Горинхеме в 1528 году, но до конца своего правления эту проблему не решила.