Маргарита была второй дочерью Генриха Хорутанского, короля Чехии (1307—1310), герцога Каринтии и графа Тироля (1310—1335), и Адельгейды Брауншвейг-Грюбенхаген. Её старшая сестра Адельгейда умерла в возрасте восьми лет в 1325 году. В 1330 году одиннадцатилетняя Маргарита была выдана замуж за семилетнего Иоганна Генриха, младшего сына чешского короля Яна Люксембургского и будущего маркграфа Моравии.
После смерти своего отца в 1335 году Маргарита осталась последним представителем Горицко-Тирольской династии. В соответствии с договором, заключённым в 1282 году между Габсбургами и Горицко-Тирольским домом, в случае прекращения мужской линии последнего его владения должны были перейти к Габсбургам. Австрийский герцог Альбрехт II немедленно оккупировал Каринтию и Крайну, однако в Тироле столкнулся с сопротивлением соседней Баварии, также претендующей на наследие Генриха Хорутанского. Согласно австро-баварскому договору 1335 года Каринтия и Южный Тироль отходили к Австрии, а северный Тироль — к Баварии. Но против раздела своей страны выступили сами тирольцы. Вспыхнуло восстание с требованием восстановления на престоле законной наследницы. Австрийцы и баварцы были вынуждены покинуть страну и признать Маргариту правительницей Тироля.
Молодая графиня нашла поддержку как у местной аристократии, так и у ландтага Тироля, который именно в это время начал усиливать своё влияние на политику, превращая Тироль в сословную монархию.
В ноябре 1341 года при поддержке тирольского дворянства, вступившего в тайный союз с императором Священной Римской империи Людвигом Баварским, Маргарита изгнала из Тироля своего мужа Иоганна Генриха. Одновременно было объявлено, что супруги не состояли в фактических брачных отношениях. На этом основании император объявил брак недействительным. Маргарита вышла замуж за его старшего сына Людвига V Виттельсбаха, маркграфа Бранденбурга 10 сентября 1342 года в Мерано. Папская курия настаивала на сохранении брака между Маргаритой и Иоганном Генрихом, и её новое супружество вызвало негодование политического противника Людвига Баварского папы римского Климента VI. Маргарита и её муж были отлучены от церкви, а на Тироль был наложен интердикт.
Скандальные обстоятельства изгнания первого мужа — Маргарита не впустила Иоганна Генриха, вернувшегося с охоты, в замок, в Тироле никто не дал ему убежища, он нашёл приют лишь у патриарха Аквилейского, и новый брак тирольской графини стали широко известны в Европе. Уильям Оккам и Марсилий Падуанский выступили в защиту Маргариты и её первого в истории средних веков «светского брака». Марсилий Падуанский написал сочинение, в котором утверждал, что император имеет право давать развод. С другой стороны, папа Климент VI, воспользовался этим инцидентом для того, чтобы опорочить своего противника и его семью и ослабить позиции императора в Европе.
В марте 1347 года Карл Люксембургский, брат первого мужа Маргариты, ставший к тому времени императором Священной Римской империи, вторгся в её владения и осадил замок Тироль. Однако Карл так и не сумел взять его и, отступая, преследуемый Людвигом, разорил Мерано и Боцен. Позднее Карл помирился с Людвигом и Маргаритой.
В 1348 году Иоганн Генрих, желая вступить в новый брак, обратился к папе с просьбой о разводе с Маргаритой. Причиной указывальсь кровное родство мужа и жены, Иоганн Генрих также признавал, что брак так и не был осуществлён, но отвергал обвинения в импотенции. Развод был оформлен 21 июля 1349 года. Однако ещё десять лет действовало отлучение от церкви Маргариты и Людвига и столько же не признавался папской курией их супружеский союз. Людвиг V, не желая конфликта с Габсбургами, восстановил мирные отношения с Австрией. При поддержке Альбрехта II, ходатайствовавшего перед папой Иннокентием VI, в 1359 году отлучение было отменено.
В 1347 году муж Маргариты стал герцогом Баварии. Это резко увеличило баварское влияние в Тироле и создало предпосылки для дальнейшего объединения государств. В 1361 году Людвиг V скончался и соправителем Маргариты в Тироле стал их сын Мейнхард III.
В 1360 годах давление со стороны Габсбургов на Маргариту Тирольскую усилилось. Австрийский герцог Рудольф IV, которому Карл IV в своей Золотой булле 1356 года отказал в праве быть даже курфюрстом, вёл активную кампанию за усиление влияния Австрии в Европе и расширение её территории. Тироль был для него важнейшим регионом, обеспечивающим связь между обширными владениями Габсбургов в Подунавье и их наследственными землями в Швабии. В 1363 году неожиданно скончался Мейнхард III, и графиня Маргарита, уступив австрийскому давлению, передала свои владения Рудольфу IV Габсбургу. Причиной её отречения были указаны «особые обстоятельства» и «слабость женского пола». Бавария пыталась воспрепятствовать установлению австрийской власти над Тиролем и вторглась на территорию графства, однако успех сопутствовал Габсбургам, которые в 1364 году разбили баварцев. В 1369 году Бавария официально отказалась от своих претензий, получив за это огромную денежную компенсацию. Таким образом Тироль потерял независимость и был включён в состав Австрийской монархии.
Остаток жизни Маргарита провела при австрийском дворе и в 1369 году в возрасте пятидесяти одного года скончалась в Вене. Один из районов Вены носит её имя: Вена-Маргаретен. По условию Рудольфа IV Маргарита не должна была больше посещать Тироль. Согласно действующим в Германии правилам наследования, её права должны были перейти Фредерику III, королю Сицилии и сыну двоюродной сестры Маргариты. Однако сицилийский король не имел ни возможности, ни желания конфликтовать с Габсбургами, и Тироль навсегда остался во владении Австрии.
Известно единственное прижизненное изображение Маргариты Тирольской: на её личной печати — стройная женщина в полный рост, черты лица разобрать трудно. По описанию её современника, хрониста Иоганна фон Винтертура, Маргарита была очень красивой женщиной. Спустя почти два столетия фламандский художник Квентин Массейс написал сатирический портрет Маргариты, обыгрывая ставшей притчей во языцех её уродливость. Однако насколько отвратительной в действительности была внешность графини, судить невозможно: на другом портрете XVI века она изображена достаточно нейтрально. Образ «самой уродливой женщины в истории» не мог не найти своего отражения в искусстве. В 1816 году Якоб Гримм, один из братьев Гримм, собрал легенды о Маргарите Тирольской, опубликовав их в сборнике «Немецкие саги». Портрет «Уродливой герцогини» работы Квентина Массейса, часто рассматриваемый как карикатура на Маргариту Тирольскую, вдохновил Джона Тенниела на создание образа Герцогини в его знаменитых иллюстрациях к книге Льюиса Кэррола «Алиса в стране чудес». В 1923 году Лион Фейхтвангер посвятил Маргарите свой второй исторический роман — «Безобразная герцогиня Маргарита Маульташ», где достаточно верно передал жизненный путь Маргариты Тирольской.