Маргарита была старшей из дочерей английского короля Генриха VII и Елизаветы Йоркской. Её старший брат Артур умер в юношеском возрасте. Младшему же, Генриху, была уготована судьба одного из самых знаменитых монархов Англии. Как и её брат, Генрих VIII, Маргарита обладала волевым и страстным характером, также как и отменным здоровьем. Однако их отношения не были столь уж тёплыми. С младшей сестрой Марией у неё не было совершенно ничего общего. В дальнейшем потомкам этих трёх отпрысков Генриха VII и Елизаветы Йоркской суждено будет чуть ни целый век бороться за английский трон друг против друга.
В соответствии с условиями англо-шотландского мирного договора 1502 г. Маргарита была обручена с королем Шотландии Яковом IV. Летом 1503 г. принцесса прибыла в Шотландию. Её сопровождал пышный свадебный кортеж из самых знатных дворян обоих государств. 8 августа 1503 г. в Холирудском аббатстве состоялась свадьба Якова IV и Маргариты, «Чертополоха и Розы», как романтически назвал молодую пару ведущий шотландский поэт эпохи Уильям Данбар. Несмотря на огромные расходы, затраченные шотландским королем на организацию свадебных торжеств, Маргарита первоначально не могла смириться с относительной скромностью шотландского двора, по сравнению с английским, и писала своему отцу полные отчаянья письма. Возможно также, что на настроение молодой королевы сказалась разница в возрасте с супругом: к моменту заключения брака Якову IV было уже тридцать лет, а Маргарите лишь тринадцать.
После смерти в 1509 г. отца Маргариты, короля Генриха VII, на престол Англии взошел её брат Генрих VIII. Англо-шотландские отношения сразу же испортились. Положение осложнял тот факт, что Генрих VIII пока не имел детей, и наследницей престола являлась Маргарита. Претензии шотландской королевской четы на английскую корону хорошо демонстрирует то, что второго своего сына, родившегося в 1509 г., Яков IV и Маргарита назвали Артуром — в честь легендарного короля Британии (правда этот ребёнок не дожил до двух лет). В условиях обострения англо-шотландских отношений королева Маргарита пыталась убедить Якова IV сохранять мир, но в 1513 г. шотландский король вступил в войну с Англией и был убит в битве при Флоддене.
После смерти мужа Маргарита стала регентом Шотландии при своём годовалом сыне Якове V. Однако её английское происхождение, а также её второй брак, заключённый в 1514 г. с Арчибальдом Дугласом, 6-м графом Ангусом, восстановил против королевы большинство шотландских дворян. В результате в мае 1515 г. пост регента был передан Джону Стюарту, герцогу Олбани, а Маргарита была вынуждена на время покинуть страну. После её примирения с Олбани и возвращения в Шотландию она была восстановлена в своих владениях, но была лишена возможности видеться с сыном.
В период правления герцога Олбани Маргарита, в основном, находилась в оппозиции к профранцузской политике регента. Однако в то же время она не была и агентом влияния английского короля в Шотландии: лидером «английской» партии стал второй муж королевы граф Ангус, с которым она с 1517 г. находилась в крайне плохих отношениях и инициировала процедуру развода. В 1524 г., вступив в союз с графом Арраном, Маргарита стала участницей смещения Олбани и вновь получила пост регента Шотландии. Однако графу Ангусу удалось захватить короля Якова V и оттеснить королеву и Аррана от управления страной. Несмотря на то, что большая часть шотландской знати отказала Ангусу в поддержке, ему удавалось на протяжении трёх лет сохранять свою власть в Шотландии. Тем временем завершился развод королевы, и она смогла вновь выйти замуж — на этот раз за Генри Стюарта, позднее ставшего лордом Метвеном.
Весной 1528 г. Маргарита организовала побег Якова V из Эдинбурга, где он содержался под надзором Ангуса. Молодой король прибыл в Стерлинг, крепость своей матери. Вскоре в Стерлинг собрались все крупнейшие шотландские бароны, которые организовали ополчение и изгнали Ангуса из страны. После начала самостоятельного правления Якова V королева одно время оставалась в составе королевского совета, но постепенно отношения с сыном осложнились: король заподозрил свою мать в участии в заговоре, инспирированном Генрихом VIII с целью захвата Якова V. Отказ короля от дачи согласия на развод матери с её третьим мужем также не способствовал улучшению отношений.
В 1541 г. Маргарита Тюдор скончалась. Правнук Маргариты, король Шотландии Яков VI, унаследовавший её права на престол Англии, в 1603 г. станет английским королем после смерти последней из дочерей Генриха VIII.