Марио Сантана начал свою карьеру в молодёжном составе клуба «Сан-Лоренсо», а в 1999 году дебютировал в основе клуба. За 3 сезона в команде Сантана провёл за клуб 33 матча (забив 2 гола) и выиграл с клубом клаусуру и Кубок Меркосур в 2001 году.
В январе 2002 года Сантана перешёл в клуб «Венеция», дебютировав в команде 24 марта в домашней игре с клубом «Аталанта», в которой «Венеция» проиграла 0:1, сам же Сантана вышел на замену вместо Игли Ваннукки во втором тайме. Всего за пол-сезона, проведённых за «Венецию», Сантана вышел на поле всего 4 раза, а клуб занял последнее место в чемпионате, «с треском» вылетев в Серию B.
Летом 2002 года президент «Венеции» Маурицио Дзампарини решает продать свою часть акций клуба и покупает контрольный пакет акций клуба «Палермо», также новый президент решает увести с собой и молодого аргентинца Сантану. Сантана постепенно завоёвывает доверие тренеров клуба, а сама команда из Серии B поднимается в Серию А.
В межсезонье 2003 Сантана, на правах аренды, уезжает в клуб «Кьево», в «Кьево» Санта проводит 28 матчей и забивает 4 мяча, став одним из лидеров того сезона, а также получает, наконец, вызов из сборной Аргентины.
Когда срок аренды закончился, Сантана вернулся в «Палермо». За 2 следующих сезона Саната выходит на поле в 58-ми матчах, забив 3 мяча. 16 марта 2006 года в матче на Кубок УЕФА с немецким «Шальке-04» Сантана получает тяжелую травму, перелом третьего поясничного позвонка, который вынуждает игрока 2 месяца оставаться без мяча. Несмотря на то, что Сантана все же смог играть в последним матчах чемпионата, его, твёрдого игрока, если не основы, но запаса уж точно, сборной Аргентины, всё же отцепили от главной команды, поехавшей на чемпионат мира 2006 в Германию.
27 мая 2006 года Сантана за 5 миллионов евро перешёл из «Палермо» в «Фиорентину», подписав контракт на 4 года. Спортивный директор «Фиорентины» Панталео Корвино подписал игрока после того, как главный тренер клуба Чезаре Пранделли купить универсального футболиста, умеющего играть на фланге и в центре поля, чему Сантана полностью соответствовал. В одной из первых партий за «фиалок» на кубок Италии против «Джарре» Сантана получил травму бедра, что вновь вынудило его лечиться, на этот раз два с половиной месяца. Возвратившись на поле в матче с «Реджиной», Сантана сразу же поразил ворота соперника, этот гол стал первым, забитой Сантаной за «Фиорентину». Через некоторое время в матче с «Торино» Сантана получает рецидив травмы, из-за которого он вновь отсутствует в команде некоторое время. За первый год в клубе, игрок выходит на поле только 8 раз и забивает лишь 1 мяч.
Во втором сезоне в составе «фиалок» Сантана уже обошёлся без травм, а 23 декабря 2007 года он сделал первый «дубль» в чемпионате Италии, забив два мяча в ворота «Кальяри», всего за сезон Сантана забил 6 мячей в 26 матчах, хотя игры он проводил неровно, чередуя удачные матчи с почти провальными. Летом Сантана договорился о переходе с английским «Тоттенхэмом», но сделка сорвалась. Также он вёл переговоры с «Ромой».
В начале сезона 2008—2009 Чезаре Пранделли меняет тактику с 4-3-3 на 4-3-1-2, а Сантана в новой схеме становится атакующим полузащитником. 28 января 2009 года Сантана забивает свой первый гол в сезоне в ворота «Наполи». 2 февраля 2009 года, после игры с «Болоньей», у Сантаны была обнаружена трещина в малой и большой берцовых костях, а также разрыв крестообразных связок правого колена; эти травмы вынудили футболиста досрочно закончить сезон.
10 ноября 2009 года Сантана получил травму бедра. 22 апреля 2010 года Сантана в игре с «Сан-Миниато Бассо» получил рецидив старой травмы — разрыв крестообразных связок правого колена и выбыл из строя на 5 месяцев.
В 2011 году Фиорентина приняла решение не продлевать контракт с аргентинцем. Тогда же им заинтересовался «Наполи». 12 июля футболист стал игроком неаполитанцев.