Через восемь дней после кончины Анастасии «Митрополит, Святители, Бояре торжественно предложили ему искать невесты: законы пристойности были тогда не строги». Иван намеревался жениться на сестре польского короля Екатерине, однако последний потребовал за это Псков, Смоленск и Новгород.
В 1560 году царь послал сватов Ф. В. Вокшерина и С.Мякинина на Кавказ «у Черкаских князей дочерей смотрети». 15 июля 1561 года княжна Кученей, «из черкас пятигорских девица», приехала в Москву вместе с братом Салтанкулом (в крещении Михаилом). Им отвели хоромы вблизи Кремля. Вскоре, царь «княжне Черкасской велел быть на своем дворе, смотрел ее и полюбил».
Вскоре в дворцовом Благовещенском соборе собравшимся боярам и духовенству объявили, что Гошаней готовится к обряду крещения и будет наречена Марией — во имя святой Марии Магдалины. В тот же день царь назвал ее своей невестой и по древнему русскому ритуалу вручил своей суженой кольцо и платок, унизанный жемчугом. Была крещена под именем «Мария» митрополитом Макарием. После завершения обряда крещения Иван Васильевич по обычаю преподнес Марии золотой крест-складень, а царевичи Иван и Федор вручили ей кресты, украшенные алмазами и жемчугом.
21 августа состоялось венчание в Успенском соборе. Молодых венчал митрополит Макарий. Видимо, свадебным подарком было блюдо из Оружейной палаты (диаметр — 42,3 см, вес — почти 3 кг), декорированное чернью, на котором, вероятно, ей поднесли свадебный головной убор. Изготовленное из трехкилограммового куска золота свадебное блюдо Марии Темрюковны считается одним из шедевров, сделанных русскими мастерами золотого дела.
Брак Ивана, заключённый вскоре после кончины его первой жены Анастасии Романовны, привёл к возвышению родственников Марии — князей Черкасских, в дальнейшем игравших большую роль в русской истории. Один из её племянников — Хорошай-мурза, во св. крещении Борис Камбулатович, был женат на родной сестре патриарха Филарета Никитича, Марфе.
Английский дипломат Джером Горсей писал: «После этого (смерти Анастасии) он (Иван) женился на одной из черкесских княжен, от которой, насколько известно, у него не было потомства. Обряды и празднества, сопровождавшие эту женитьбу, были столь странными и языческими, что трудно поверить, что все это происходило в действительности».
Единственный её ребёнок, о котором известно — царевич Василий Иванович — умер в двухмесячном возрасте в мае 1563, погребён, по-видимому, в Архангельском соборе, но его надгробие не сохранилось.
В 1562 году и в другие годы сопровождала царя в объезде по монастырям. В июле 1563 года ездила из Александровой слободы с царевичем Иваном Ивановичем на богомолье в Суздаль, а оттуда в Ростов.
В русской истории традиционно принято придавать образу Марии Темрюковны негативные черты и считать её отрицательным персонажем в жизни Ивана Грозного, дурно повлиявшего на его характер. Некоторые современники обвиняли «злонравную» Марию в «порче нрава» царя и переходе к террору.
В одном из источников она называется «на злые дела падущая». В другом — хронографе «О браках царя Иоанна Васильевича» — сказано: «В лето 7069 августа 21 обрачился царь вторично на Марии Черкасской Горской… туги нравные и зело лютые…» (крутой нравом и очень злой). Генрих Штаден пишет, что именно она подала ему совет о создании опричнины:
Царь Иван сударь Васильевич,
Содержатель он всей Руси,
Сберегатель каценной Москвы,
При блаженной его памяти,
Поизволил царь женитися:
Он берет не у нас в Москве,
Он берет в иной земле,
У того-ли Темрюка-Мастрюка,
Молодого Черкешинина,
Toe малую сестру.
Да свет Марию Темрюковну,
Он и много приданого берет:
Двести татаринов,
Полтараста бояринов
И семь сот Донских казаков.
Что ни лучших добрых молодцов.
Он же пишет, говоря об отце царицы Темрюке, что «великий князь бесчестно обошелся с его дочерью». Комментаторы замечают по поводу этой фразы, что с известием Штадена о «бесчестии» царя в отношении жены перекликаются сообщения Пискаревского летописца: «а тогда же опоил царицу Марью Черкаскову», и Горсея: «тем временем он отдалил свою черкесскую жену, постриг ее в монахини и поместил в монастырь», также недостоверные — видимо, он путает её с одной из следующих жён.
Мария Темрюковна умерла 6 сентября 1569 в Александровой слободе после возвращения из длительного путешествия в Вологду. Как часто указывают, в новогоднюю ночь 1 (14 сентября) 1569 года под утро она скончалась. Но, судя по надгробной эпитафии, она умерла «6 сентября 1569 г. в седьмом часу ночи, то есть в переводе на современный суточный счет часов — незадолго до полуночи. Встречающаяся в историографии дата 1 сентября, которая восходит к Н. М. Карамзину, по всей видимости, ошибочна, поскольку Карамзин ссылается на надгробную надпись с более позднего надгробного памятника, установленного над могилой Марии (надписи XIX в. на надгробиях мужчин великокняжеского и царского рода в Архангельском соборе содержат ошибки по сравнению с эпитафиями XVII в. на тех же надгробиях)».
В полдень Михаил Темрюкович, Алексей и Фёдор Басмановы, Афанасий Вяземский, Борис Годунов, Глинский, Милославский и Вельский вынесли из царских покоев покрытый шелковыми материями гроб с телом Марии и установили его на погребальный возок. Траурный кортеж двинулся в Москву.
Как и после смерти Анастасии, Иван подозревал бояр в том, что они её «извели», утверждая, что она «злокозньством отравлена бысть».
Мария Темрюковна была похоронена в Вознесенском соборе кремлевского Вознесенского монастыря у западной стены храма рядом с царицей Анастасией Романовной (слева от её захоронения). В настоящее время (с 1929 г.) ее гробница в подклети Архангельского собора Кремля.
В 1929 г. сотрудниками кремлёвского музея гробницы из обречённого на уничтожение Вознесенского собора были перенесены в подвальную палату Архангельского собора, где они находятся и по сей день. При вскрытии захоронения Марии Темрюковны был обнаружен скелет, завернутый в саван. «Ткань саван, по определению В. К. Клейн (тогдашний заместитель директора Оружейной палаты по научной работе), итальянская камка XVI в. хорошей сохранности на внешних частях. У левого плеча найден восточный сосудик — медная сулейка. Бок её со стороны плеча проржавел и утрачен. Сосуд изъят из гробницы». Хорошо сохранился головной убор царицы — волосник, обнаруженный кремлевскими археологами под руководством Т. Д. Пановой при исследовании захоронений бывшего Вознесенского монастыря в 1984 году. Череп её плохо сохранился, поэтому восстановить скульптурный портрет невозможно.