Родился и вырос в образованной еврейской семье, где говорили как на идише, так и на русском языке. Глава семейства, Яков (Я?нкель-Бе?ндет Ио?селевич) Роткович, работал аптекарским помощником, но, несмотря на скромный доход, много внимания уделял образованию детей; мать, Хая Мо?рдуховна Роткович (урожд. Гольдина), была домохозяйкой. В возрасте 5 лет Маркус поступил в хедер, где изучал Пятикнижие и Талмуд, в то время как остальные дети продолжали получать светское образование.
Глава семейства Ротковичей, опасаясь того, что детей заберут на службу в царскую армию, решил эмигрировать в США, следуя примеру многочисленных еврейских семей, бежавших от погромов. В Америку уже уехали двое братьев Якова Ротковича, которые обосновались в Портленде, штат Орегон и занялись производством одежды. Маркус остался в России с матерью и старшей сестрой.
5 августа 1913 года пароход «Царь» вышел из Либавы. Среди пассажиров на борту были молодой человек Марк Ро?тко и его семья, которые направлялись в США к своему отцу. Они присоединились к Якову и старшим детям позже, зимой 1913 года. Через несколько месяцев отец Маркуса умер. Семья осталась без средств к существованию, и всем детям приходилось работать. Маркус помогал своему дяде, продавая газеты сотрудникам на складе.
В 1913 году Маркус поступил в общеобразовательную школу, и его перевели из третьего в пятый класс. В 17 лет он с отличием закончил школу Lincoln High School. Он в совершенстве овладел английским (четвертый язык Марка) и стал активно участвовать в жизни местного еврейского сообщества, особенно в политических дискуссиях.
Марк поступил в Йельский университет, где первый год учился благодаря полученному за отличный аттестат гранту, а позднее, когда дотация закончилась, работал, чтобы оплачивать учебу. В университете Марк, вместе с товарищем Аароном Директором, выпускал сатирический журнал, направленный на разоблачения пороков университетского общества WASP («Белых англо-саксонских протестантов»). Вскоре Марк бросил университет, и вернулся туда только 46 лет спустя, получать почетную степень доктора.
Осенью 1923 года Ротко, навещая друга в Школе Искусств в Нью-Йорке (Art Students League of New York), увидел, как художники рисовали модель. Как позднее говорил сам Ротко, в этот момент он родился как художник. Некоторое время спустя он поступил в «Новую школу дизайна» в Нью-Йорке, где одним из его преподавателей стал один из основателей «абстрактного сюрреализма» Аршиль Горки. Осенью того же года Ротко ходил на курсы в «Лигу студентов искусств Нью-Йорка» к Максу Веберу, влияние которого сказывается в ранних работах Ротко. Именно с тех пор он стал воспринимать искусство как инструмент эмоционального и религиозного самовыражения.
Переехав из Портленда в Нью-Йорк, Марк Ротко окунулся в бурную атмосферу художественной жизни большого города. Тогда молодого художника впечатлили сюрреалистические работы Пауля Клее и живопись Жоржа Руо. В 1928 году Ротко, с группой молодых художников, впервые выставил свои работы в галерее Оппортьюнити (Opportunity gallery). Темные экспрессивные полотна — изображения интерьеров и городские зарисовки — были хорошо приняты критиками и коллегами. Несмотря на этот скромный успех, Ротко все еще не мог целиком посвятить себя творчеству — ему необходимо было работать. В 1929 году он начал преподавать живопись и скульптуру в Центральной Академии (Center Academy); он проработал там до 1952 года. Именно тогда он встретил Адольфа Готлиба, который, вместе с другими молодыми художниками (Barnett Newman, Joseph Solman, Louis Schanker, John Graham), входил в круг учеников Мильтона Авери. Стиль Авери, его работа с цветом и текстурой оказали огромное влияние на Ротко: в его работах появились схожие мотивы и цвета (см. Купание или Сцена на пляже 1933/34).
Молодые художники много времени проводили вместе с Авери, путешествуя, работая вместе над картинами, обсуждая искусство. В 1932 году, во время поездки на Озеро Джордж, Ротко познакомился с Эдит Сахар, дизайнером ювелирных украшений. Вскоре они поженились.
В 1933 году состоялась первая сольная выставка в Музее Искусства Портленда, США. Там были представлены его рисунки и акварели, а также работы студентов Ротко из Центральной Академии Нью-Йорка. Семья художника не поняла его решения посвятить себя искусству. Из-за Великой Депрессии Ротковичи многое потеряли; родных Марка удивляло его безразличие и нежелание заняться более «перспективной» и «выгодной» работой, чтобы помочь матери.
На первой персональной выставке в Нью-Йорке Ротко выставил 15 полотен, написанных маслом — в основном портреты, а также рисунки и акварели. На той выставке стало очевидным мастерство Ротко, который перерос влияние Авери: работа Ротко с цветовыми полями впечатлила критиков. В конце 1935 года Ротко объединился с Ильей Болотовским, Бен-Зион, Адольфом Готлибом, Лу Харрисом, Ральфом Розенборгом, Луисом Шейкером и Иосифом Сольманом. Они создали «Группу десяти» («The Ten» — Whitney Ten Dissenters), чья миссия (согласно каталогу выставки галереи «Меркюри» 1937 года) звучала так: «Протестовать против распространенного мнения о равенстве Американской живописи и буквальной живописи». Еще в 1950 году они считались радикалами, и консервативное жюри не приняло их картины на важную выставку современного искусства в Метрополитен-музее. В ответ они сделали групповое фото «Разгневанных» — все с суровыми лицами, ни тени улыбки. Особенно рассержен Марк Ротко. Стиль Ротко уже изменился, он приближался к знаменитым работам зрелого периода, однако, несмотря на интерес к изучению цвета, художник сконцентрировался на другой формальной и стилистической инновации, работая над сюрреалистичными изображениями мифологических историй и символов. Органические, полуабстрактные формы, рожденные его фантазиями и сновидениями, получили название биоморфных. В это время растет авторитет Ротко, особенно в среде Союза художников. Основанный в 1937 году, этот союз, в который входили также Готлиб и Сольман, ставил себе целью создать муниципальную галерею искусств, где можно было бы устраивать самостоятельные групповые выставки. В 1936 году группа Союза Художников устроила свою выставку в Галерею Бонапарт, во Франции (Galerie Bonaparte). В 1938 году еще одна выставка прошла в галерее Меркюри (Mercury Gallery). В тот период Ротко, как и многие художники того времени, начал работать в государственной организации, созданной для преодоления последствий Депрессии, которая привлекала художников и архитекторов для восстановления и реновации общественных зданий. В те времена на службе у государства работали многие известные художники, в том числе Авери, ДеКунинг, Поллок, Рейнар, Давид Смит, Луиз Невельсон, восемь художников из «Группы Десяти», и учитель Ротко — Аршиль Горки.
В 1936 году Ротко начал писать книгу, которая так и не была закончена, о сходных принципах детского рисунка и работ современных ему художников. По мнению Ротко, «тот факт, что художественная работа начинается с рисунка — уже академический подход. Мы начинаем с цвета» — писал художник, сравнивая влияние примитивных культур на модернистов с мимикрическими предпосылками детского творчества. Ротко считал, что модернист, как ребенок и человек примитивной культуры, повлиявшей на него, должен в идеальной и оптимальной работе, выразить внутреннее ощущение формы без вмешательства разума. Это физический и эмоциональный, не интеллектуальный опыт. Ротко стал использовать цветовые поля в своих акварелях и городских ландшафтах, именно тогда предмет и форма в его работах теряют смысловую нагрузку. Ротко сознательно стремился имитировать детские рисунки. C 1929 года более 20 лет он обучал детей в Еврейском центре Бруклина. В 1938 году он обратился за получением американского гражданства и начал работать под творческим псевдонимом Марк Ротко только в 1940-м году, укоротив Маркуса Ротковича. К началу 1950-х годов он еще более упростил структуру своих картин, создав серию «мультиформы» — картин, состоящих из нескольких цветовых плоскостей. Сам художник формулировал свою задачу как «простое выражение сложной мысли». Работы, уже тогда прославившие его, — это прямоугольные полотна большого размера с парящими в пространстве цветовыми плоскостями живописи «цветового поля».
При этом он говорил: «Не следует считать мои картины абстрактными. У меня нет намерения создавать или акцентировать формальное соотношение цвета и места. Я отказываюсь от естественного изображения только для того, чтобы усилить выражение темы, заключенной в названии». Но большая часть его абстрактных полотен не имели названия.
Критики считают наиболее значительной работой Ротко цикл из 14 картин для капеллы экуменической церкви в Хьюстоне в штате Техас.