Михаил Исаакович Мукасей родился в Замостье Слуцкого уезда Минской губернии (ныне — Слуцкий район Белоруссии) в еврейской семье потомственных кузнецов. В 18 лет отправился получить образование на рабфаке в Ленинград, учился в Институте восточных языков, специализируясь на бенгальском и английском языках. В 1937 году по распоряжению ЦК ВКП(б) стал слушателем школы Разведуправления Рабоче-Крестьянской Красной Армии.
В 1939 году вместе с супругой, Елизаветой Ивановной Мукасей (урожд. Емельянова, 1912—2009), и двумя детьми выехал на работу по линии военной разведки в Лос-Анджелес (США). Родители и семья Мукасея, оставшиеся в Замостье, были вместе с другими евреями посёлка расстреляны немцами в начале Великой Отечественной войны. В 1943 году Мукасей с женой и детьми возвратился в Москву и был назначен заместителем начальника учебной части специальной разведшколы.
В 1955 году вновь выехал на нелегальную разведывательную работу в Швейцарию, где пользуясь свободным владением идишем, легализовался под видом выжившего в концлагере и прошедшего лагеря для перемещённых лиц еврея-коммерсанта. Работал в США и ряде других стран (в том числе в 1967—1968 годах во время Шестидневной войны — в Израиле) под кодовым именем «Зефир».
В 1977 году Михаил Мукасей с семьей возвратился в Москву, занимался подготовкой молодых нелегалов, написал учебные пособия для разведшкол, был профессором российской Академии проблем безопасности, обороны и правопорядка.. В декабре 2004 года супруги Мукасей издали книгу своих воспоминаний «Зефир и Эльза», в которой написали о работе и жизни за рубежом в течение 30 лет.
Сын — Анатолий Михайлович Мукасей, советский и российский кинооператор. Невестка — актриса и кинорежиссёр Светлана Сергеевна Дружинина. Внук — кинооператор Михаил Анатольевич Мукасей (род. 3 января 1966).