Мир-Хосейн Мусави родился 29 сентября 1941 года в городе Хамене провинции Восточный Азербайджан в азербайджанской семье. Его отец, Мир-Исмаил, был торговцем чая из Тебриза, а бабушка приходилась сестрой отцу Али Хаменеи, который занимал посты президента и Высшего руководителя Ирана. В 1969 году Мусави окончил Национальный университет Ирана (ныне Университет Шахид Бехешти) со степенью магистра по архитектуре. Изучал традиционную и религиозную архитектуру.
Они его жена Захра Рахнавард принимали активное участие в Исламской революции, приведшая к свержению шахского режима в стране.
15 августа 1981 года Мир-Хосейн Мусави был назначен министром иностранных дел. Однако 20 августа президент Ирана Мохаммад Али Раджаи и премьер-министр Мохаммад Джавад Бахонар и ещё несколько человек погибли в результате взрыва, организованного Моджахедин-е Халк. На президентских выборах, прошедших в октябре того же года, победил Али Хаменеи. Он предложил Али Акбара Вилаяти в качестве нового главы правительства, но иранский парламент отклонил его кандидатуру. Впоследствии Хаменеи согласился выдвинуть Мусави на пост премьер-министра и 28 октября парламент Ирана утвердил Мир-Хосейна Мусави в качестве нового главы правительства.
Мусави возглавлял иранское правительство на протяжении семи лет Ирано-иракской войны. За время работы на этом посту он сумел завоевать репутацию трезвого прагматика и симпатии большого числа представителей всех слоёв иранского общества. Он имел поддержку со стороны аятоллы Хомейни, и остался в памяти людей как лидер правительства, который выступал против всякого инакомыслия.
Однако период пребывания Мир-Хосейна Мусави во главе правительства сопровождался политической борьбой между традиционалистами и фундаменталистами, усилением соперничества в высших сферах исламской власти за влияние в правительстве, в частности между ним и приверженцами председателя Меджлиса Хашеми-Рафсанджани. Летом 1983 года, вследствие трудностей и недовольства населения политическим курсом правящего режима, приверженцы Хомейни спровоцировали выступление «базари» и городских низов против кабинета Мусави. 31 июля Хомейни утвердил отставку двух министров, известных как сторонников «Ходжатие». 17 декабря 1983 года Хомейни высказался против критики правительсва, потребовав от духовенства поддержать кабинет Мусави, подчеркнув, что «Сегодня, когда мы вступили в войну со всем миром, с Западом и Востоком, с США и СССР, мы не можем отрезать голову собственному правительству. Отставка кабинета Мусави в нынешних условиях будет означать поражение исламской революции». 12 августа 1984 года Меджлис под давлением Хомейни выразил доверие Мир-Хосейну Мусави, но спустя два дня сторонники Хашеми-Рафсанджани обвинили пятерых министров кабинета правительства в их связях с обществом «Ходжатие», вынудив их уйти в отставку, места которых заняли приверженцы Хашеми-Рафсанджани.
На прошедших 15 августа 1985 года президентских выборах, Хаменеи был переизбран на пост главы государства. Утверждение же Мусави на второй срок в качестве главы правительства проходило с немалыми трудностей. Поддержку ему выразила аятолла Монтазери и Хомейни, заявивший в сентябре того же года, что "неразумно менять премьер-министра в то время, когда страна ведёт войну". Хаменеи, заявлявший, что «голосовать против Мусави — значит голосовать против Хомейни», позднее строго отчитал 73 депутатов Меджлиса, отказавшихся 13 октября проголосовать за резолюцию доверия правительству Мусави. В свой новый кабинет Мусави вынужден был ввести ряд видных деятелей из руководства «Партии Аллаха».
Мусави проработал на своём посту до последнего дня президентства Хаменеи, 3 августа 1989 года он ушёл в отставку. За несколько дней до этого, 28 июля 1989 года одновременно с президентскими выборами, победу на которых одержал Али Акбар Хашеми Рафсанджани (Хаменеи был назначен преемником скончавшегося Хомейни) , прошёл референдум о поправках к конституции, которые в числе прочего упразднили пост премьер-министра.
9 марта 2009 года, после двадцати лет отсутствия на политической сцене, Мусави объявил, что будет участвовать в июньских президентских выборах. 16 марта экс-президент Ирана Мохаммад Хатами, также выступивший соискателем на пост, отказался от борьбы в пользу кандидатуры Мусави.
Мусави занял реформистскую позицию и критиковал консервативную политику действующего президента Ирана Махмуда Ахмадинежада. По словам экспертов, Мусави пользовался поддержкой интеллигенции, молодежи и средних слоев населения Ирана, которые были недовольны засильем духовенства и навязыванием пуританских обычаев. Его также называли кандидатом, с которым было бы проще вести диалог президенту США Бараку Обаме, хотя Мусави заявлял, что в случае своего избрания не будет отказываться от ядерной программы.
Несмотря на то, что опросы общественного мнения свидетельствовали о высоком рейтинге Мусави, 12 июня 2009 года Ахмадинежад был переизбран на посту президента Ирана. За действующего главу государства отдали голоса 62,6 процента избирателей, а Мусави получил 33,8 процента, заняв второе место. После оглашения первых результатов выборов, победа Ахмадинежада была заверена аятоллой Хаменеи, однако сторонники Мусави объявили о фальсификациях и потребовали пересмотра итогов выборов. Начались массовые демонстрации сторонников Мусави, продолжавшиеся неделю и переросшие в массовые беспорядки, приведшие к человеческим жертвам и арестам сторонников оппозиции. Сам Мусави призвал своих сторонников продолжать выступления против результатов выборов избегая насилия. Несмотря на протесты, 23 июня Совет стражей конституции объявил о том, что значимых нарушений на выборах не обнаружено, и 29 июня окончательно подтвердил победу Ахмадинежада.
3 августа 2009 года высший руководитель Ирана аятолла Али Хаменеи официально утвердил Махмуда Ахмадинежада на посту президента, однако Мусави бойкотировал церемонию инагурации, состоявшуюся 5 августа 2009 года.
Зимой 2010—2011 гг. в странах арабского мира начались массовые волнения, приведшие к смене власти в Тунисе и Египте. Под влиянием этих событий в Иране опять начались акции протеста против президента страны Махмуда Ахмадинежада. В связи с этим власти Ирана заключили под домашний арест лидеров оппозиции, в том числе Мусави. 28 февраля 2011 года оппозиционные сайты сообщили, что Мусави помещён в тюрьму, хотя официальные источники эту информацию опровергли.
Мусави женат на художнице Захре Рахнавард (Zahra Rahnavard), имеет трех дочерей. Захра Рахнавард является одним из самых активных сторонников и последователей политики Мир-Хосейна Мусави.