Пятницкий родился 21 июня (3 июля) 1864 года в семье священника. Учился в Воронежском духовном училище. Одновременно с учёбой брал уроки пения у Льва Михайловича Образцова, а позднее, уже в Москве, у Камилло Эверарди.
В Москву приехал в 1897 году, с 1899 года поселился в Большом Боженинском переулке, 11. С 1899 по 1923 год работал делопроизводителем в одной из московских больниц. Но увлечённость народным музыкальным творчеством приводит его в 1902 году к созданию ансамбля народной песни. Певицы ансамбля: П. В. Козимовская, М. А. Шевченко, Р. А. Кондра, певец-бандурист В. К. Шевченко.
С 1903 года он член музыкально-этнографической комиссии при Императорском обществе любителей естествознания, антропологии и этнографии и ведёт научно-этнографическую работу. Посетил много деревнь (главным образом воронежских), записал много песен от крестьян. При этом только на фонографе он записал около 400 народных песен, часть которых была опубликована в 1904 и 1914 годах. М. Е. Пятницкий не ограничивался только собиранием песен и инструментальных наигрышей, он собрал коллекции народных инструментов и костюмов. В годы Первой мировой войны Пятницкий служил в одной из московских больниц, куда поступали раненые солдаты и другие нижние чины. Из их числа М. Е. Пятницкий создал так называемый «хор инвалидов» (в числе поющих действительно были воины-инвалиды, георгиевские кавалеры, а также и медперсонал). Многие участники хора, зачастую малограмотные и неграмотные крестьяне в прошлом, впервые изучили нотную грамоту и приобщились к хоровому пению.
Первоначально Пятницкий записывал песни в своем родном селе Александровка, затем сгруппировал их в жанровые разделы, относящиеся к определенной песенной традиции, и опубликовал в 1904 году в своем первом сборнике «12 русских народных песен (Воронежской губернии Бобровского уезда)». 1904, 1910, 1920, 1925 годы, это годы, посвящённые наиболее плодотворным этнографическим поездкам.
«Народная песня, — говорил М. Е. Пятницкий, — эта художественная летопись народной жизни, к глубокому сожалению вымирает с каждым днем… Деревня начинает забывать свои прекрасные песни… Народная песня исчезает и ее надо спасать».
В 1910 году М. Е. Пятницкий создаёт хор из народных певцов Воронежской и Рязанской губерний, который впоследствии был назван его именем.
В 2 марта 1911 года хор впервые выступил в Москве в зале Благородного собрания.
С 1921 по 1925 годы М. Е. Пятницкий преподаёт пение в Третьей студии МХАТ (ныне — Театр им. Е. Б. Вахтангова) и на протяжении всей своей жизни является бессменным руководителем хора.
Умер Митрофан Ефимович 21 января 1927 года и похоронен на Новодевичьем кладбище в Москве.