Родился 3 марта 1858 года в Иркутске, в семье врача. В двухлетнем возрасте, в связи с назначением отца на новое место службы, вместе с семьёй переехал в Петербург. Начальное образование получил в 1-й классической гимназии, которую окончил в 1875 году. В этом же году поступил в Медико-хирургическую академию и окончил её в 1880 году, но твёрдого намерения быть практикующим врачом у него не было. После окончания академии, подготовившись самостоятельно, он выдерживает экзамены на степень кандидата на физико-математическом факультете Санкт-Петербургского университета. Полученный диплом открывал ему дорогу для службы и для работы по зоологической специальности.
В 1885 был избран по конкурсу приват-доцентом по кафедре зоологии, а с 1902 — профессором Лесного института в Петербурге. В 1892 становится профессором Военно-медицинской академии по кафедре зоологии и сравнительной анатомии, заняв её после смерти своего учителя Э. К. Брандта
Николай Холодковский — автор трудов по различным разделам зоологии, главным образом по энтомологии и паразитологии. Также он составил учебные руководства по зоологии и энтомологии. Особый интерес представляют его исследования сложных циклов развития хермесов — вредителей хвойных деревьев. Холодковский был приверженцем эволюционного учения Чарльза Дарвина и публиковал свои научно-популярные работы по теории эволюции и общим вопросам биологии, способствовавшие широкому распространению дарвинизма в России. Холодковский решительно выступал против идеализма в естествознании.
Главным литературным достижением Холодковского считается перевод «Фауста» И. В. Гёте, за который в 1917 Академией наук ему была присуждена премия им. А. С. Пушкина. Кроме того, он перевёл поэму Эразма Дарвина «Храм Природы» и ряд произведений Дж. Байрона, Ф. Шиллера, У. Шекспира, Дж. Мильтона, Г. Лонгфелло и других.
В 1947 году Академия Наук СССР учредила премию им. Н. А. Холодковского по энтомологии. Президиум Академии наук постановил проводить ежегодно в день смерти Н. А. Холодковского (2 апреля) научные чтения, посвященные вопросам энтомологии, паразитологии и биологии.