Николай Гамалея родился в 1859 году в Одессе. Его дед М. Л. Гамалея (1749—1830) был врачом, написал в 1789 году монографию о сибирской язве, которая была переведена на немецкий язык.
В 1880 году Николай закончил Новороссийский университет (ныне Одесский), а в 1883 году Петербургскую военно-медицинскую академию. После учёбы он вернулся в Одессу, где начал работать в больнице О. О. Мочутковского (проработал там 49 лет). Н. Гамалея одним из первых в Российской империи начал развивать отечественную бактериологию. В 1885 году на конкурсной основе Николая Федоровича избрали для командировки в Париж в лабораторию Луи Пастера для углубления опыта в области бактериологии.
По приезде в Париж Н. Гамалея на протяжении года изучал в лаборатории Л. Пастера бешенство. Изучив метод приготовления вакцины и методику прививки против бешенства, Н. Ф. Гамалея вернулся в Одессу. Здесь, совместно с И. И. Мечниковым, он основал городскую лабораторию (ныне — НИИ им. И. И. Мечникова) для проведения научно-исследовательской работы, где вскоре начал прививку подопытных животных (кроликов).
В 1886 году, при содействии Луи Пастера, Н. Ф. Гамалея учредил совместно с И. И. Мечниковым и Я. Ю. Бардахом первую в России (и вторую в мире) бактериологическую станцию и впервые в России осуществил вакцинацию людей против бешенства. За первые 3 года своей деятельности Одесская станция сделала прививку приблизительно 1500 человек. Смертность, составлявшая около 2,5 %, с усовершенствованием метода снизилась до 0,61 %.
В 1887 году активизировалась консервативная критика относительно Луи Пастера и его методов лечения — его подвергли жёсткой обструкции на заседании Парижской медицинской академии. В результате в Англии была создана специальная комиссия по проверке пастеровского метода во главе с известным профессором Педжетом. Имея на руках накопленный на тот момент опыт работы Одесской бактериологической станции и убедительную статистику её успешных прививок, Н. Гамалея выехал в Англию, где выступил на заседании комиссии, организовав уверенную защиту новаторских идей Луи Пастера и бактериологов.
В течение пяти последующих лет Николай Гамалея, постоянно находясь между Парижем и Одессой, помогал Пастеру в борьбе с реакционными научными работниками, приобретая теоретический и практический опыт. Практика прививок в Одессе, углубленная научными поисками Николая Фёдоровича Гамалеи и его сотрудника доктора Я. Ю. Бардаха послужили основанием для учёных полностью подтвердить принципы пастеровского метода.
В 1892 году, вернувшись в Россию, Н. Ф. Гамалея защитил докторскую диссертацию «Этиология холеры с точки зрения экспериментальной патологии» (опубликована в 1893 году).
С 1899 по 1908 год он был директором основанного им Бактериологического института в Одессе. В рамках его деятельности изучал роль корабельных крыс в распространении болезни, а в 1901—1902 годах Николай Гамалея руководил противоэпидемическими мероприятиями во время вспышки чумы в Одессе, организовав сплошную дератизацию. В последующие годы вёл борьбу с холерой на юге России. В 1908 году впервые доказал, что сыпной тиф передается через вшей. Он также много работал над профилактикой тифов, холеры, оспы и других инфекционных заболеваний. В 1910 году впервые обосновал значение дезинсекции в целях ликвидации тифа. В 1910—1913 годах Н. Ф. Гамалея издавал и редактировал журнал «Гигиена и санитария».
В 1912 году Н. Ф. Гамалея переезжает на постоянное место жительство в Санкт-Петербург. С 1912 по 1928 год он руководил Петербургским (Петроградским) оспопрививательным институтом имени Дженнера. По инициативе Н. Ф. Гамалеи, с помощью разработанного им метода приготовления противоосповой вакцины, в 1918 году в Петрограде была проведена всеобщая прививка от оспы, принятая затем по всей стране, согласно декрету от 10 апреля 1919 года, подписанного В. И. Лениным. В 1918-1919 годах Н. Ф. Гамалея изучал методы приготовления вакцины от сыпного тифа.
С 1930 по 1938 год Н. Ф. Гамалея — научный руководитель Центрального института эпидемиологии и микробиологии в Москве (в настоящее время носит его имя). С 1938 года и до конца жизни Н. Гамалея работал профессором кафедры микробиологии 2-го Московского медицинского института, с 1939 года — заведующий лабораторией института эпидемиологии и микробиологии АМН СССР.
С 1939 года Н. Ф. Гамалея — Председатель, впоследствии Почётный председатель Всесоюзного общества микробиологов, эпидемиологов и инфекционистов.
В последние годы жизни учёный разрабатывал вопросы общей иммунологии, вирусологии, изучал оспу, грипп (в 1942 году им был представлен метод профилактики гриппа путём обработки слизистой оболочки носа препаратами олеиновой кислоты), интенсивно разрабатывал проблему специфического лечения туберкулёза. Член ВКП(б) с 1948 года.
Николай Фёдорович Гамалея умер 29 марта 1949 года в Москве; похоронен на Новодевичьем кладбище.
Николай Фёдорович Гамалея — автор более 300 научных работ, значительная часть которых, посвящена проблематике бешенства и холеры.
В 1954—1956 годах было издано шеститомное собрание научных трудов Н. Ф. Гамалеи.
Создатель и активный популяризатор так называемого интенсивного метода прививки — он разработал и применил на практике план мероприятий по борьбе с эпидемиями на местах. На практике активно боролся с эпидемиями чумы в Одессе, холеры на Донбассе, в Закавказье и в Поволжье, сыпного тифа в Санкт-Петербурге.
В 1888 году Гамалея открыл холероподобный птичий вибрион (мечниковский вибрион) — возбудителя холероподобного заболевания птиц и представил противохолерную вакцину. В 1894-1896 годах Гамалея описал явление так называемого гетероморфизма бактерий. Н. Гамалея впервые выдвинул положение о существовании скрытых форм инфекции. Ещё в 1899 году учёный выразил мнение о «невидимых микробах» — возбудителях рака. Вирусной теории рака он придерживался до конца своей жизни.
Учёный воспитал целую плеяду советских микробиологов, которые своими трудами и открытиями прославили имя своего учителя.
Н. Ф. Гамалея одним из первых определил эпидемиологическое значение дезинфекционных мероприятий в борьбе с холерой и дератизационных - в борьбе с чумой. Основываясь на опыте борьбы с паразитарными тифами в ночлежках домах Петербурга, он впервые показал ведущую роль дезинсекционных мероприятий в борьбе со вшивостью при этих инфекциях, изучал действие некоторых дезинфекционных средств и их эффективность. Для него уже в то время стала ясна роль мух в передаче кишечных инфекций и необходимость усиленной борьбы с ними. Он также показал роль грызунов в заносе и распространении чумы и необходимость обязательного истребления их во всех случаях. Н.Ф. Гамалея - один из основоположников дезинфекционного дела в нашей стране. Несмотря на усилия передовых ученых того времени, дезинфекционное обслуживание населения царской России было поставлено неудовлетворительно. По существу какой-либо системы организации дезинфекционного дела в дореволюционной России вовсе не существовало.
В 1948 году на 90 году жизни Н.Ф. Гамалея подал заявление на вступление в члены ВКП(б), сославшись на обещание стать членом партии, которое он дал в своё время В.И.Ленину.