В 1846 окончил Казанскую духовную академию, где был оставлен в должности учителя естественных наук и «турецко-татарских языков»; в 1847 ему присвоена степень магистра и бакалавра той же академии.
В 1851—1854 Ильминский командирован в Константинополь, Дамаск, Каир и другие города Ближнего Востока. По возвращению из этого путешествия с осени 1854 преподавал на миссионерском (противомусульманском) отделении Казанской духовной академии восточные языки и некоторые другие предметы.
В эти годы Н. И. Ильминский впервые в истории тюркологии готовит к изданию (по списку Г.-Я. Кера) чагатайский текст «Бабур-наме». Вскоре издает другой важный средневековый памятник — «Кысас ал-анбийа» (Казань, 1859).
В 1855-1856 у Н. И. Ильминского, выработавшего систему просвещения направленную на усиление православия среди нерусских народов Поволжья, Средней Азии и Сибири, сложилось твердое убеждение, что
Поэтому Ильминский не считал нужным преподавать студентам специальную «полемику против Мухаммеданства». Отступление от учебной программы и «крамольные идеи» вызвали недовольство начальства, что вынудило Ильминского в конечном счете уйти из духовной академии.
Ильминский, выйдя из духовного звания (вместе со своим единомышленником A.A. Бобровниковым), перешёл на гражданскую службу. С 31 декабря 1858 года он — переводчик Оренбургской Пограничной комиссии, где познакомился с казахским просветителем Алтынсарином.
В 1859 году принял участие в экспедиции для съёмки восточного берега Каспийского моря (то есть на территории Туркмении), начиная почти от Мангышлака до персидской границы; эта экспедиция продолжалась с 1 мая по октябрь.
С декабря 1861 переехал в Казань. Совмещает чтение лекций на кафедре турецко-татарского языка историко-филологического факультета Казанского университета, а с 1863 года — и преподавание восточных языков в Казанской духовной академии с работой над учебными пособиями для татар на татарском языке.
В 1868 году Ильминский стал одним из основателей и руководителем вновь образованной Постоянной переводческой комиссии, при миссионерском Братстве Святителя Гурия (образована согласно высочайше утвержденным Правилам 18.03.1868), состоявшей из трёх членов Совета братства и решавшей вопрос о качестве и необходимости тех или иных переводов.
19 августа 1872 года перешел на должность директора вновь открытой в Казани инородческой учительской семинарии.
С 1870 года — член-корреспондент Императорской Академии Наук. На пост академика баллотироваться отказался в пользу В. В. Радлова.
Два основных пункта в его просветительной системе: