Родился 27 апреля (8 мая) 1744 в родовом имении Тихвинское-Авдотьино, близ села (ныне города) Бронницы Московской губернии. Отец — Иван Васильевич Новиков (ум. 1763). Его семья относилась к дворянам среднего достатка. В детстве он учился у деревенского дьячка, затем, в возрасте 11-16 лет, в Московской дворянской гимназии при Московском университете (1755-60), откуда был исключен «за леность и нехождение в классы».
В начале 1762 года поступил на службу в лейб-гвардии Измайловский полк и, как часовой у подъёмного моста измайловских казарм в день воцарения Екатерины II, был произведен в унтер-офицеры. Уже во время службы в полку Новиков обнаруживал «вкус к словесным наукам» и склонность к книжному делу: издал две переводные французские повести и сонет (1768).
В 1767 году Новиков был в числе молодых людей, которым было поручено ведение протоколов в комиссии депутатов для сочинения проекта «Нового Уложения». Императрица считала это поручение делом высокой важности и предписала «к держанию протокола определить особливых дворян со способностями». Новиков работал в малой комиссии о среднем роде людей и в большой комиссии. Участие в работах комиссии ознакомило Новикова со многими важными вопросами, выдвинутыми русской жизнью, и с условиями русской действительности, стала важным этапом в формировании его просветительских взглядов. При докладах о работах комиссии Новиков стал лично известен Екатерине.
В 1769 Новиков вышел в отставку и стал издавать еженедельный сатирический журнал «Трутень». Журнал «Трутень» (1769—1770) проводил мысль о несправедливости крепостного права, вооружался против злоупотреблений помещичьей властью, бичевал неправосудие, взяточничество и т. п., выступая с обличениями против очень влиятельных сфер, например против придворных. По вопросу о содержании сатиры «Трутень» вступил в полемику со «Всякой Всячиной», органом самой императрицы Екатерины II. В полемике принимали участие и другие журналы, разделившиеся на два лагеря. «Всякая Всячина» проповедовала умеренность, снисходительность к слабостям, «улыбательную сатиру», осуждая «всякое задевание особ». «Трутень» стоял за смелые, открытые обличения. Борьба, однако, была неравная, «Трутень» сначала должен был умерить тон, совершенно отказаться от обсуждения крестьянского вопроса, а затем Новиков, получив намек о возможном закрытии журнала в апреле 1770 года перестает его издавать.
В 1772 Новиков выступил с новым сатирическим журналом — «Живописцем», лучшим периодическим изданием XVIII века. «Живописец» проводил те же идеи, что и «Трутень»: в ряде статей, из которых одни принадлежали И. П. Тургеневу, другие приписывались А. Н. Радищеву, он сильно и горячо ратовал против крепостного права.
Новиков сознавал необходимость в издании исторических памятников палеографической точности, свода разноречий, составления алфавитных указателей и т. п., иногда прилагал эти приёмы при пользовании несколькими списками (например, в «Идрографии»). Материал для своих изданий памятников старины Новиков черпал из древлехранилищ частных, церковных, а также государственных, доступ к которым был разрешён ему императрицей в 1773. Новиков сам составил себе собрание рукописей исторического содержания. Много материалов доставляли ему Миллер, князь Щербатов, Бантыш-Каменский и другие, также Екатерина II, поддержавшая издание «Вивлиофики» щедрыми субсидиями.
В своих взглядах на русскую старину Новиков не всегда отличался устойчивостью. Древние российские государи, по его словам, «якобы предчувствовали, что введением в Россию наук и художеств наидрагоценнейшее российское сокровище — нравы — погубятся безвозвратно»; но вместе с тем он — ревностный приверженец просвещения, почитатель Петра Великого и тех людей, труды которых на пользу русского просвещения он любовно заносил в свой «Опыт исторического словаря о российских писателях» (1772 год). Исход этих колебаний и противоречий Новиков нашёл в масонстве.
Первые связи Новикова с масонством начались в Петербурге. Друзья ещё в 1775 году зазывали его в масонство, но он долго колебался, не желая связывать себя клятвой, предмет которой ему был неизвестен. Масоны, очевидно, очень дорожили вступлением Новикова, так как, вопреки своим правилам, сообщили ему содержание первых трёх «степеней» до вступления его в ложу. Новиков, однако, не был удовлетворён елагинской системой, в которую он вступил, и только позже он нашёл «истинное» масонство в системе Рейхеля, в которой «было все обращено на нравственность и самопознание».
Ежемесячный журнал, прекратив «Ведомости», Новиков стал издавать с сентября 1777, сначала в Петербурге, с апреля 1779 — в Москве. Он считается первым в России философским журналом. Здесь были опубликованы «Нощи» Юнга, «Мнения» Паскаля, но главным образом переводы из немецких писателей, моралистов, пиетистов и мистиков. «Утренний Свет» издавался при содействии целого кружка единомышленников, в числе которых были М. Н. Муравьёв и И. П. Тургенев, и притом с целями благотворительными: весь доход с издания предназначался на устройство и содержание в Петербурге первоначальных народных училищ. В этом сказались уже две основные черты позднейшей деятельности Новикова: уменье организовать общественную самодеятельность и стремление работать на пользу просвещения. Обращение к подписчикам журнала, с приглашением содействовать образованию училищ, вызвало обильный приток пожертвований.
Уже в ноябре 1777 Новиковым было открыто Училище при церкви Владимирской Божией Матери на 30 или 40 человек, с пансионерами и приходящими учениками, платными и даровыми, впоследствии названное Екатерининским. В следующем году было открыто второе училище (Александровское, при церкви Благовещения на Васильевском острове). Оба эти училища существовали ещё в 1782 (в пользу их издавались следовавшие за «Утренним Светом» «Московское Издание» и «Вечерняя Заря»); дальнейшая судьба их неизвестна.
В 1779 Херасков, который был куратором Московского университета и также масоном, предложил Новикову взять в аренду университетскую типографию и издание «Московских Ведомостей». Новиков переехал в Москву, и здесь начинается третий и наиболее блестящий период его деятельности. Быстро приведя в порядок и значительно расширив университетскую типографию, Новиков менее чем в три года напечатал в ней больше книг, чем сколько вышло из неё в 24 года её существования до поступления в руки Новикова.
Наряду с издательством книг, Новиков поднял и значение «Московских ведомостей», к которым стал прилагать прибавления разнообразного содержания; число подписчиков увеличилось всемеро (с 600 до 4000). В 1781 Новиков издавал продолжение «Утреннего Света», под названием «Московского ежемесячного издания». Затем следовали периодическое издание «Городская и деревенская библиотека» (1782—1786), в 1782 «Вечерняя Заря», в 1784—1785 «Покоящийся Трудолюбец», в котором Новиков возобновил свою борьбу с крепостным правом, первый русский детский журнал «Детское чтение» (1785—1789). Своей издательской деятельностью он хотел создать достаточно обильный и легко доступный запас полезного и занимательного чтения для обширного круга читателей, вовсе не ограничиваясь пропагандой своих мистических воззрений.
С целью удешевления книг Новиков вступил в сношения со всеми существовавшими тогда книжными лавками, заводил комиссионеров, отпускал книгопродавцам на льготных условиях товар в кредит, иногда десятками тысяч экземпляров, устраивал книжную торговлю не только в провинциальных городах, но и в деревнях. В Москве, где до тех пор существовали только две книжных лавки, с оборотом в 10 000 рублей, при Новикове и под его влиянием число их возросло до 20. Они продавали книг ежегодно двести тысяч. Также он учредил в Москве первую библиотеку для чтения.
В обществе, где даже звание писателя считалось постыдным, надо было иметь немалую долю решимости, чтобы стать типографщиком и книжным торговцем и видеть в этих занятиях своё патриотическое призвание. Люди, близкие к тому времени к Новикову, утверждали, что он не распространил, а создал у нас любовь к наукам и охоту к чтению. Сквозь вызванную им усиленную работу переводчиков, сочинителей, типографий, книжных лавок, книг, журналов и возбужденные ими толки стало, по замечанию В. О. Ключевского, пробиваться то, с чем ещё не был знакомо русское просвещенное общество: общественное мнение.
Деятельность Новикова была в расцвете, когда над ним собиралась уже гроза. Прежде всего заявила к нему претензии (в 1784) комиссия народных училищ за перепечатку некоторых учебников, ею изданных. Новиков делал это по распоряжению московского главнокомандующего Чернышева и не для прибыли, а для того, чтобы в продаже было достаточно дешёвых учебных книг. Но Чернышев тем временем умер, и Новикову пришлось выдать комиссии вознаграждение.
В 1785 было повелено составить изданиям Новикова опись и передать их на рассмотрение московского архиепископа Платона, который должен был также испытать в вере самого Новикова. В своём донесении Платон разделил издания Новикова на три разряда: одни он считал весьма полезными при бедности нашей литературы; других, мистических, он, по его словам, не понимал; третьи, составленные французскими энциклопедистами, он считал зловредными. О вере Новикова Платон писал: «Молю всещедрого Бога, чтобы во всем мире были христиане таковые, как Новиков».
В 1790 в Москву назначен был главнокомандующим князь Прозоровский, человек невежественный, подозрительный, жестокий, выдвигавшийся угодничеством. Он посылал на Новикова доносы, вызвавшие отправление в Москву графа Безбородко для производства негласного дознания; но Безбородко не нашёл никаких поводов к преследованию Новикова. В апреле 1792 Прозоровскому послан был указ расследовать, не печатает ли Новиков, в противность закону, книг церковной печати. По приказу Прозоровского Новиков был арестован.
Ещё до окончания следствия императрица указом от 10 мая 1792 повелела тайно перевезти Новикова в Шлиссельбургскую крепость, где новые допросы делал ему Шешковский. Наконец, 1 августа 1792 императрица подписала указ о заключении Новикова в Шлиссельбургскую крепость на 15 лет. Новиков обвинялся в «гнусном расколе», в корыстных обманах, в деятельности масонской (что не было запрещено ни раньше, ни после), в сношениях с герцогом брауншвейгским и другими иностранцами (сношения эти касались исключительно масонства и никакого политического значения не имели). Все эти обвинения указ относит не к одному Новикову, а ко всем его соучастникам-масонам; пострадал же один только Новиков, хотя он даже не считался главой московских масонов. Даже князь Прозоровский был поражён исходом дела Новикова: «Я не понимаю конца сего дела, — писал он Шешковскому, — как ближайшие сообщники, если он преступник, то и они преступники».
Ещё Карамзин, выразивший сочувствие к судьбе Новикова в своей «Оде к Милости», искал причины осуждения Новикова не в официально выставленных против него обвинениях и на первом месте поставил раздачу Новикова хлеба голодающим, которая казалась подозрительной, так как не знали источника затраченных им при этом средств. Всего вероятнее, что Новиков пострадал за свою слишком, по тогдашним понятиям, самостоятельную общественную деятельность. Четыре с половиной года провел Новиков в крепости, терпя крайнюю нужду в самом необходимом, даже в лекарствах, хотя заключение его самоотверженно разделял д-р Багрянский.
Император Павел I в первый же день своего царствования освободил Новикова. Новиков был заключён в крепость ещё в полном развитии его сил и энергии, а вышел оттуда «дряхл, стар, согбен». Он вынужден был отказаться от всякой общественной деятельности и до самой своей смерти (31 июля (12 августа 1818) прожил почти безвыездно в своём Авдотьине, заботясь лишь о нуждах своих крестьян, об их просвещении и т. п. В Авдотьине сохранилась благодарная о нём память.
Именем Николая Ивановича Новикова названа первая масонская ложа, учреждённая 30 августа 1991 года в Москве под эгидой Великой ложи Франции. В конце августа 2011 года ложа «Николай Новиков» отметила своё 20-летие.