Автор новаторских методик в кардиологии, автор системного подхода к здоровью («метод ограничений и нагрузок»), дискуссионных работ по геронтологии, проблемам искусственного интеллекта и рационального планирования общественной жизни («социальной инженерии»). Академик АН УССР (1969) и Национальной Академии Наук Украины, Герой Социалистического Труда (1973).
Родился в крестьянской семье, в деревне Ольхово Вологодской губернии. Мать была акушеркой. Жили бедно — мать на работе не принимала подарков и это послужило примером на всю жизнь. С 12 до 18 лет учился в Череповце, в школе, потом в механическом техникуме, окончил его и стал механиком. Жил бедно и одиноко. Осенью 1932 г. начал работать в Архангельске, начальником смены рабочих, на электростанции при большом лесопильном заводе — новостройке первой пятилетки. В 1934 году женился на Гале Соболевой и начал учиться в Заочном индустриальном институте. В том же году умерла мать. В 1935 вместе со своей первой женой поступил в Архангельский медицинский институт, окончил его с отличием в 1939. Хотел заниматься физиологией, но свободные места в аспирантуре были лишь в хирургии. Параллельно учился в Заочном индустриальном институте и в 1940 также получил диплом инженера с отличием.
На войне был полевым хирургом, прооперировал более 4000 раненых. В 1944 заключил второй брак (с медсестрой Лидией Денисенко). В марте 1953 защитил докторскую диссертацию и возглавил кафедру в Киевском медицинском институте. В 1960 году возглавил отдел биокибернетики Института кибернетики Академии наук Украины. В 1968 году был назначен на должность заместителя директора по науке Киевского научно-исследовательского института туберкулеза и грудной хирургии. Одновременно он возглавлял кафедру грудной хирургии Института усовершенствования врачей (1955—1970). С 1983 — директор Института сердечно-сосудистой хирургии. За огромные заслуги перед Украиной Николая Амосова признали «человеком века на Украине».
С 1962 по 1979 год избирался депутатом Верховного Совета СССР, народным депутатом СССР (1989—1991). 12 декабря 2002 года умер от инфаркта, похоронен на Байковом кладбище в Киеве.
Супруга — Денисенко Лидия, окончила Киевский медицинский институт, работала хирургом, физиотерапевтом. Дочь — Екатерина Николаевна (р. 1956), доктор медицинских наук, член-корреспондент Украинской медицинской академии. Внучка — Анна.