Николай Вагнер родился 18 (30) июля 1829 года в Верхотурском уезде Пермской губернии (ныне город Карпинск Свердловской области) в дворянской семье.
Детство Вагнер провёл на Урале, где работал врачом его отец, Пётр Иванович Вагнер. С 1840 года, когда отец был утверждён профессором минералогии, геологии и сравнительной анатомии Казанского университета, жил в Казани. В 1841 году Николай Вагнер обучался в частном пансионе М. Н. Львова, затем с 1842 по 1845 год учился во 2-й Казанской гимназии.
В 1845 году Вагнер поступил на отделение естественных наук Казанского университета (окончил в 1849 году со степенью кандидата с золотой медалью за сочинение «О лучших характерных признаках для классификации насекомых»). С 1848 года начал печататься: в журнале «Русская иллюстрация» вышли его научно-популярные статьи на темы зоологии «Жуки-атехви» и «Жуки-могильщики».
После университета Вагнер преподавал естественную историю и сельское хозяйство в Нижегородском Александровском дворянском институте. В 1851 году получил степень магистра зоологии за работу «О чернобылках, водящихся в России». В 1852 году становится адъюнктом при физико-математическом факультете Казанского университета, магистр, затем доктором (1855, диссертация «Общий взгляд на паукообразных»). С 1858 года неоднократно выезжал за рубеж в научные командировки. С 1860-го — профессор зоологии, с 1862-го — ординарный профессор зоологии Казанского университета. В 1861—1864 годах Вагнер — редактор «Учёных записок Казанского университета». В 1863 году получает Демидовскую премию Академии наук за исследование «Самопроизвольное размножение у гусениц насекомых», ставшее сенсацией в научном мире того времени. В 1869 году был удостоен премии Бордена от Парижской академии наук и избран почётным членом Сибирского университета.
В 1870—1885 годах — профессор Санкт-Петербургского университета (продолжал читать лекции до 1894 года). Основал на Соловецком острове на Белом море биологическую станцию и был её директором до конца существования станции.
В 1877—1879 годах редактор научно-популярного журнала «Свет». C 1891 года — президент Русского общества экспериментальной психологии, с 1899 — почётный член Казанского университета. В 1901 году издал научно-популярные очерки книгой «Картины из жизни животных».
Умер от прогрессивного паралича 21 марта (3 апреля) 1907 года в Петербурге.
Его сын, литератор Владимир Николаевич, застрелил собственную жену.
В 1854 году в Москве Вагнер познакомился с С. Т. и К. С. Аксаковыми и под их влиянием увлёкся славянофильством. До середины 70-х годов считал себя атеистом и дарвинистом (хотя признавался, что, впервые прочитав Евангелие в 1851 году после сильной болезни, испытал религиозный экстаз), читал А. И. Герцена, К. Фохта, Л. Бюхнера, Я. Молешотта.
В 1847 году побывал на спиритических сеансах и стал убеждённым спиритом, много писал о спиритизме, полемизировал с Д. И. Менделеевым и другими критиками спиритизма. Принял на свой счет насмешки Л. Н. Толстого над спиритизмом в комедии «Плоды просвещения».
В 1875—1877 годах переписывался с Ф. М. Достоевским.
Известен главным образом как детский писатель.
Первое произведение написал в 1869 году, когда журнал «Нива» объявил премию в тысячу рублей за повесть из русской жизни, однако товарищи убедили Вагнера не отсылать повесть в журнал. Впоследствии она вышла в «Русской мысли» как роман под названием «К свету» в 1883 году.
В 1872 году в издательстве «Общества переводчиц» Н. В. Стасовой и М. В. Трубниковой вышли его популярные «Сказки Кота-Мурлыки», которые потом неоднократно переиздавались. По собственному признанию автора, на него оказали влияние «Сказки и истории» Андерсена, изданные тем же «Обществом переводчиц» в середине 60-х годов.
В книгу «Сказки Кота-Мурлыки» вошло двадцать пять философских сказок и притч, из которых «Телепень», «Любовь великая», «Царевна Мелина» и другие выходили отдельными изданиями вплоть до революции. Последнее десятое издание «Гиза» вышло в 1923 под редакцией Тумской.
Характерными особенностями сказок Вагнера являются своеобразный мистицизм («Мила и Нолли», «Макс и Волчок», «Песенка земли»), символизм и аллегория («Курилка», «Царевна Мелина» или «Чудный мальчик»), сочетающиеся часто с суровым реализмом («Без света», «Телепень»). Основная тема их — неизбежность горя, страдания и неустройства человеческого общества. Выходом из непрекращающейся борьбы добра со злом для автора является мистицизм и расплывчатая вера в лучшее будущее. Так, Макс, умирая, говорит Волчку: «Верь, что когда-нибудь всем будет лучше жить; верь и борись во имя этой веры» («Макс и Волчок»).
Иногда автор находит выход и примирение по ту сторону жизни («Пимперле»).
Заметное место в творчестве Вагнера занимает жанр рождественского рассказа («Новый год», «Телепень», «Пимперлэ»).
Вагнер высмеивает ханжество и фарисейство. Сказки Вагнера вызвали в своё время горячую полемику в педагогической среде; часть педагогов считала их далёкими и чуждыми для детей, слишком психологичными.
У массового юного читателя сказки не встречали большого сочувствия, но на отдельных детей, особенно в восьмидесятых и девяностых годах XIX века, производили иногда исключительное впечатление. Но огромное количество переизданий, выдержанное сборником сказок в течение двух десятилетий, говорит об известной популярности сказок Вагнера.
Написал также антисемитский роман «Тёмный путь» (1881—84; 1890), вызвавший бурную полемику и резкую критику в литературных кругах.
Ряд произведений Вагнера (роман «Тёмный путь», повести «Впотьмах» и «Ольд-Дикс») содержат элементы научной фантастики. В них, частности, высказан ряд научных предвидений — фрейдизм, информатика, космические полёты и др.