Беттини рос на тосканском побережье, начал участвовать в велогонках с семи лет, на что его сподвиг брат. В 1996 году никто из неитальянцев не смог опередить Беттини в групповой гонке молодёжного чемпионата мира, но перед ним финишировали сразу трое его соотечественников. В следующем сезоне он подписал первый профессиональным контракт, с «MG-Technogym». Два года Беттини работал на Микеле Бартоли, чем помог ему оба раза выиграть UCI Road World Cup. В 1999 года оба итальянца перешли в «Mapei», но Бартоли получил травму колена, и Беттини вышел на первые роли. В 2000 году он выиграл Льеж — Бастонь — Льеж, после чего успешно выступал и в других престижнейших однодневках. В том же году Беттини женился на учительнице Монике Орландини, и переехал в дом её родителей у оливковой плантации, в 10 километрах от его родной Чечины. Вскоре он поругался с Бартоли, апофеозом стал провал командной тактики на чемпионате мира 2001.
Частые финиши в первой десятке важнейших однодневок принесли Беттини первое место рейтинга по итогам 2002 года, он не отдавал лидерство и в следующие 2 года. 2003 год, начиная с которого он выступал за «Quick Step», начался для Беттини победой на Милан — Сан-Ремо, однако из-за травмы итальянец пропустил другие весенние классики. Вернувшись, он первенствовал в Классике Сан-Себастьяна и Ваттенфаль Классик. У итальянца были хорошие шансы на победу в чемпионате мира, но на финише он упустил рывок Игора Астарлоа. Испанец затем утверждал, что Беттини предлагал ему деньги в обмен на победу, однако позже заявил, что это недоразумение. В 2004 году итальянец трижды был вторым в классиках, но победы так и не добился. Однако неудачи затмило золото на Афинской Олимпиаде: Беттини вместе с Сержио Паулиньо оторвался от пелотона, а в спринтерской развязке одолел португальца. В 2005 году он выиграл Чемпионат Цюриха и Джиро ди Ломбардия, а также спринтерский зачёт на Джиро, где он 4 этапа ехал в розовой майке. Однако в первом UCI ProTour итальянец стал только 8-м.
В 2006 году Беттини наконец стал чемпионом мира, но радость затмила смерть его брата Сауро через несколько дней в автокатострофе. Последнюю гонку сезона, Джиро ди Ломбардия, Паоло выиграл со слезами на финишной черте. По итогам сезона Беттини получил «золотой велосипед». На Вуэльте Испании 2007 он выиграл этап, а ещё 3 закончил вторым. Через несколько дней Беттини снова стал чемпионом мира, выиграв спринт в отрыве. В 2008 году он получил несколько травм, но в сентябре выиграл 2 этапа Вуэльты. Там же он заявил, что покидает «Quick Step» из-за финансовых споров, а ещё через несколько дней объявил о завершении карьеры.
В феврале 2010 года Беттини должен был участвовать в ралли вместе с другом, главным тренером итальянской сборной Франко Баллерини, но был вынужден отказаться из-за занятости. Его заменил Алессандро Чиарди, который разбил машину, в результате чего штурман Баллерини погиб. В июне Беттини принял руководство сборной. В групповой гонке чемпионата мира итальянцы хорошо работали на своего спринтера Филиппо Поццато, но тот стал лишь четвёртым.