Маргарита Ивановна Гладунко родилась в 1929 году в Умани на территории УССР. В двадцать лет состоялся её дебют в театре.
Карьера актрисы началась для Риты в 1949 году на сцене провинциального Бердичевского драматического театра. Через два года перешла работать в драматический театр Тернополя. Затем переехала в Белоруссию, выступала в Минском драмтеатре им. М.Горького в 1953-54 году. С 1955 по 1960 была актрисой Белорусского академического театра имени Янки Купалы.
В 1956 году состоялся её дебют в кино. Сергей Сплошнов и Иосиф Шульман пригласили Маргариту Гладунко на Беларусьфильм для съёмок в фильме «Зеленые огни», действие которого разворачивается на одном из железнодорожных узлов Белоруссии. Сплошнов дал ей роль и в следующем своём фильме «Наши соседи», повествующем о жизни одной коммунальной квартиры. Но по-настоящему знаменитой Рита Гладунко стала после выхода военного фильма «Часы остановились в полночь», основанного на реальных фактах. Она сыграла роль молоденькой разведчицы, благодаря которой партизаны казнили наместника Гитлера в Белоруссии фон Кауница (в реальной жизни - гауляйтер Белоруссии Вильгельм фон Кубе). На Всесоюзном кинофестивале Гладунко стала лауреатом номинации Первый приз за женскую роль за роль Марины Казанич.
1960 год ознаменовался для актрисы главной ролью в драме «Весенние грозы». Вместе с Надиром Малишевским они сыграли супругов, разлучённых войной. Считая Ольгу погибшей, Виктор женился снова. Она же была в фашистском плену, и вот — вернулась. Он думал, что счастлив с новой женой, но вот — вновь увидел первую любовь.
Потом были роли в фильмах «Гулящая» (режиссёр Иван Кавалеридзе), по мотивам романа Панаса Мирного, «Радость моя», снимавшемся на киностудии им. А. П. Довженко в Киеве, «Город — одна улица», где Рита снялась с Виктором Авдюшко и много других.
Всего Рита Гладунко снялась более чем в 30 фильмах.