Роберт Милликен родился в семье священника. Перед поступлением в колледж Оберлин в Огайо работал некоторое время репортёром. В 1891 г. получил степень бакалавра по классике — языку, философии, истории и искусству древнего средиземноморья. В 1896 г. получил степень доктора по физике в Колумбийском университете. В своей автобиографии он так объяснил столь разительную смену темы изучения:
После завершения обучения он преподавал в различных местах, в том числе один год проработал в университетах Берлина и Гёттингена. В 1896 г. возвращается в США, где становится ассистентом профессора физики, а затем и профессором физики в Чикагском университете.
В 1904 г. женился на Грете Бланшар. У них было три сына — Кларк, Гленн и Макс, которые впоследствии также стали учёными.
В 1910 году, будучи профессором в Чикагском университете, Милликен опубликовал первые результаты своих экспериментов с заряженными капельками масла (), при помощи которых он измерил заряд электрона. Элементарный электрический заряд является одной из фундаментальных физических констант и знание его точного значения очень важно. В своих экспериментах Милликен измерял силу, действующую на мельчайшие заряженные капельки масла, подвешенные между электродами при помощи электрического поля. При известном значении электрического поля можно определить заряд капли. Проведя повторные эксперименты с большим количеством капелек, Милликен показал, что результаты могут быть объяснены, если предположить, что заряд капли пропорционален целому числу элементарных зарядов, величиной ?1,592·10?19 кулон. Несколько меньшее значение, чем принятое на сегодняшний день ?1,60217653·10?19 кулон, объясняется тем, что Милликен использовал неточные значения коэффициента вязкости воздуха.
Когда Альберт Эйнштейн в 1905 г. опубликовал свою плодотворную статью по корпускулярной теории света, Милликен был убеждён, что эта теория неверна, так как к этому времени существовало большое количество доказательств в пользу волновой природы света. Для проверки эйнштейновской теории он предпринял серию экспериментов, продолжавшихся десять лет, которая потребовала того, что он назвал «a machine shop in vacuo» («механическая мастерская в вакууме») для приготовления очень чистой поверхности фотоэлектрода. Его результаты в точности подтвердили предсказания Эйнштейна, но это не убедило Милликена в эйнштейновской радикальной интерпретации, и в 1916 г. он написал: «Уравнение фотоэффекта Эйнштейна… по моему мнению, не может рассматриваться как имеющее хоть какое-то удовлетворительное теоретическое обоснование», — даже если «оно действительно очень точно описывает процесс» фотоэффекта. Тем не менее, в своей автобиографии 1950 г. он незатейливо высказался, что он «едва ли допускает какие-либо интерпретации, кроме первоначально предложенной Эйнштейном, а именно саму полукорпускулярную, или фотонную, теорию».
Так как работы Милликена отчасти лежат в основе современной физики частиц, ироничным кажется то, что он был весьма консервативен в своих убеждениях по поводу открытий в физике в XX веке, как в случае с фотонной теорией. В качестве ещё одного примера можно привести его учебник 1927 г. издания, где недвусмысленно утверждалось существование эфира, а эйнштейновская теория относительности в уклончивой форме упоминалась лишь в примечании в конце главы под портретом Эйнштейна, которое завершало список достижений и гласило, что он стал «автором специальной теории относительности в 1905 г. и общей теории относительности в 1914 г.; обе теории явились большим достижением в объяснении явлений, не объяснимых никак иначе, и в предсказании новых явлений». Также признавалась заслуга Эйнштейна в измерении значения постоянной Планка из графиков фотоэлектронной эмиссии для различных металлов.