Роберт Престон родился в Ньютоне, штат Массачусетс, в семье Рут Л. (урождённая Ри) и Фрэнка Уэсли Мезерви, клерка American Express. Закончил среднюю школу в Лос-Анджелесе, после чего поступил в театральную школу Pasadena Playhouse. Во время Второй мировой войны Престон служил в звании офицера разведки в военно-воздушных силах США.
В 1940 году женился на актрисе Кэтрин Крэйг. В этом браке прожил всю жизнь.
Престон играл во многих голливудских фильмах, чаще в вестернах. Самым известным из воплощённых им образов считается профессор Гарольд Хилл из фильма «Музыкант» (1962 год), поставленного по одноимённому мюзиклу Мередита Уиллсона (ранее в котором также играл Престон). В 1957 году за исполнение этой роли он получил премию «Тони». Популярность актёра была столь высока, что его фото было опубликовано на обложке журнала «Time» от 21 июля 1958 года. С 1965 года он начал играть в дуэте с Мэри Мартин в мюзикле «I Do! I Do!», за который в 1974 году вновь стал лауреатом «Тони». Престон также исполнил роль Мака Сеннета в бродвейском мюзикле Джерри Хермана «Mack and Mabel».
В 1961 году Престону было предложено сделать запись в рамках программы Президентского совета по физической культуре, одной из целей которой было побудить школьников больше заниматься спортом. Песня Chicken Fat, написанная Мередитом Уиллсоном и исполненная Престоном, была распространена в школах по всей стране и играла для учеников каждое утро.
В 1979 и 1980 годах Престон сыграл главу семейства Хэдли Чисхолма в мини-сериале CBS «The Chisholms». Розмари Харрис исполнила роль его жены Минервы. Персонаж Престона умер в девятом из тринадцати эпизодов сериала. По сюжету Чисхолмы стали жертвами аферы, в результате чего потеряли свою землю в Виргинии. После этого они уехали в Калифорнию, чтобы начать новую жизнь.
Роберт Престон также известен и по другим ролям в кино, в частности по киномюзиклу «Виктор/Виктория» (1982 год), за который он получил номинацию на премию «Оскар» за лучшую мужскую роль второго плана. Его последняя роль в большом кино была исполнена в картине «Последний звёздный боец» (1984 год), в которой он сыграл инопланетянина-вербовщика Центаури, создавшего видеоигру «Звёздный Боец». Престон позже признался, что списал характер Центаури с профессора Гарольда Хилла. Вместе с Мэри Тайлер Мур снялся в фильме «Finnegan Begin Again», показанному по каналу HBO в 1985 году. Свою последнюю роль Престон сыграл в телефильме Насилие! (1986 год).
Роберт Престон умер от рака лёгких 21 марта 1987 года в возрасте 68 лет.