Семён Гамалея родился в 1743 году в городе Китайгород Полтавского полка (ныне — село Царичанского района Днепропетровской области) в семье священника. С 1755 по 1763 год учился в Киевской академии. Активно занимался просветительской деятельностью.
С 1769 года преподавал латынь в Императорском сухопутном кадетском корпусе в Санкт-Петербурге. С 1770 года служил в Сенате, в 1774 году был назначен управителем канцелярии наместника Полоцкой и Могилёвской губерний графа З. Г. Чернышёва, с 1782 года — на такой же должности в Москве.
Семён Иванович Гамалея входил в ряды московских мартинистов, и оказал заметное влияние на развитие религиозно-мистических идей в российской духовной жизни.
В 1784 году вышел в отставку. Последние 30 лет безвыездно проживал в селе Авдотьино Бронницкого уезда Московской губернии (в настоящее время с. Авдотьино Ступинского района Московской области), где умер и похоронен.
С. Гамалея переводил с латинского, польского, немецкого и французского языков. Перевел, очевидно, все 22 тома (не опубликованы) произведений немецкого философа Я. Бёме.
Находился в братских отношениях с российским писателем, журналистом, книгоиздателем Н. И. Новиковым.