Сергей Петрович Боткин происходит из купеческой семьи, занимавшейся торговлей чаем. В детстве хотел стать математиком, но к моменту поступления в университет вышло постановление императора Николая, которое разрешало свободный доступ для недворян только на медицинский факультет. Учился на медицинском факультете Московского университета у известных профессоров — физиолога И. Т. Глебова, патолога А. И. Полунина, хирурга Ф. И. Иноземцева, терапевта И. В. Варвинского. В период учёбы близко познакомился со своим сокурсником И. М. Сеченовым, во время их пребывания за границей после окончания университета эти отношения переросли в тесную дружбу. Летом 1854 года участвовал в ликвидации эпидемии холеры в Москве. В 1855 году окончил университет, получил звание «лекарь с отличием». В том же году участвовал в Крымской кампании под началом Н. И. Пирогова в качестве ординатора Симферопольского госпиталя. Уже в этот период сформировалась у С. П. Боткина концепция военной медицины и правильного питания солдат:
Получил обширную подготовку по различным разделам медицины за рубежом: в клинике профессора Гирша в Кёнигсберге, в патологическом институте у Р. Вихова в Вюрцбурге и Берлине, в лаборатории Гоппе-Зейлера, в клинике знаменитого терапевта Л. Траубе, невропатолога Ромберга, сифилидолога Береншпрунга в Берлине, у физиолога К. Людвига и клинициста Оппольцера в Вене, в Англии, а также в лаборатории экспериментатора-физиолога К. Бернара, в клиниках Бартеза, Бюшу, Трюссо и др. в Париже. Первые работы Боткина выходят в «Архиве Вирхова».
В конце 1859 года в клинику терапии Медико-хирургической академии (Санкт-Петербург) были приглашены Якубович, Боткин, Сеченов, Боккерс и Юнг. 10 августа 1860 года Боткин перебрался в Петербург, защитил диссертацию на соискание учёной степени доктора медицины на тему: «О всасывании жира в кишках» и назначен исполняющим обязанности адъюнкта при терапевтической клинике, возглавляемой профессором П. Д. Шипулинским. Вскоре отношения Боткина и Шипулинского испортились, и последний был вынужден подать в отставку. Однако конференция академии не хотела передавать руководство клиникой талантливому Боткину, только письмо от студентов и врачей позволило ему занять освободившуюся должность в 1861 году, и в возрасте 29 лет он получил звание профессора.
На кафедру факультетской терапии С. П. Боткин был избран в 28 лет и руководил ею на протяжении 30 лет. Распорядок дня Боткина выглядел следующим образом: приезжал он в клинику к 10 утра, с 11 часов начинались химические и микроскопические исследования, осуществляемые студентами и молодыми докторами, а также научно-исследовательская работа со старшекурсниками, с 13 часов он читал лекции студентам, после лекции следовал обход и осмотр амбулаторных больных, с 17 до 19 часов — вечерний обход клиники, с 19 до 21 часа — лекции для доцентов, на которые допускались все желающие. После этого Боткин возвращался домой, где ужинал и занимался подготовкой к следующему дню, а вот после 12 часов ночи он уделял внимание любимому делу — игре на виолончели. В своём письме Н. А. Белоголовому Боткин отмечает:
Первый камень славы С. П. Боткина как тонкого диагноста был заложен в 1862 году после его прижизненного диагноза тромбоза воротной вены. После установления диагноза больной прожил несколько недель. Недоброжелатели надеялись на ошибку. Много внимания С. П. Боткин уделял желчнокаменной болезни, которой сам страдал длительное время. Он указал на роль инфекции в образовании камней. Он подчеркивал клиническое разнообразие этого заболевания. Учёный считал, что до тех пор пока врач не обнаружит извергнутый камень, его диагноз остается гипотезой. В работе «О рефлекторных явлениях в сосудах кожи и о рефлекторном поте» С. П. Боткин приводит ряд интересных клинических наблюдений, одно из которых демонстрирует, что при прохождении камня через желчные протоки верхние и нижние конечности холодеют, кожа груди становится горячей, и температура в подмышечной впадине повышается до 40°С.
Благодаря выдающимся педагогическим способностям из клиники Боткина вышли профессора, возглавившие кафедры на медицинских факультетах российских ВУЗов, ректоры университетов, руководители научных институтов - академик И. П. Павлов, В. Т. Покровский, Н. И. Соколов, В. Н. Сиротинин, В. А. Манассеин, Ю. Т. Чудновский, А. Г. Полотебнов, Н. П. Симановский, А. Ф. Пруссак, П. И. Успенский, Д. И. Кошлаков, Л. В. Попов, А. А. Нечаев, М. В. Яновский, М. М. Волков, Н. Я. Чистович, C. В. Левашов и др. Всего 87 выпускников его клиники стали докторами медицины, из них более 40 было присвоено звание профессора по 12 медицинским специальностям. С. П. Боткин 66 раз выступал в качестве официального оппонента по диссертациям.
В 1865 году С. П. Боткин выступил инициатором создания эпидемиологического общества, целью которого была борьба с распространением эпидемических заболеваний. Общество было малочисленным, но деятельным, его печатным органом был «Эпидемический листок». В рамках работы общества Боткин изучал эпидемию чумы, холеры, тифов, натуральной оспы, дифтерии и скарлатины. Наблюдая заболевания печени, протекающие с высокой температурой, С. П. Боткин впервые описал болезнь, которую до него считали желудочно-кишечным катаром с механической задержкой жёлчи. Заболевание это проявлялось не только желтухой, но и увеличением селезёнки, иногда заболеванием почек. Болезнь, как указывал С. П. Боткин, тянется несколько недель, в дальнейшем может привести к тяжелейшему осложнению — циррозу печени. Отыскивая причины болезни, С. П. Боткин пришёл к выводу, что источником заражения служат загрязнённые пищевые продукты. Этот вид катаральной желтухи он отнес к инфекционным болезням, что и было подтверждено в дальнейшем (болезнь Боткина, вирусный гепатит А).
Боткин стоял у истоков женского медицинского образования в России. В 1874 году он организовал школу фельдшериц, а в 1876 году — «Женские врачебные курсы». В 1866 году Боткин был назначен членом Медицинского совета министерства внутренних дел. Активная жизненная позиция, интерес к общественной деятельности позволили врачебной общественности избрать С. П. Боткина в 1878 году председателем Общества русских врачей, которым он руководил до кончины. Одновременно с этим он являлся членом главного управления Общества попечения о раненых и больных воинах, гласным Петербургской думы и заместителем председателя Комиссии общественного здравия Санкт-Петербурга. Известность и врачебный талант сыграли своё дело, и С. П. Боткин стал первым в истории этническим русским лейб-медиком семьи самого императора (до этого этнически русские лейб-медики были лечащами врачами только других членов императорской фамилии). С. П. Боткин положил начало санитарным организациям в Санкт-Петербурге. С первых лет существования Александровской барачной больницы становится её попечителем по врачебной части (отсюда и название, употребляемое в Санкт-Петербурге — Боткинские бараки - ныне клиническая инфекционная больница им. С. П. Боткина). Во многом именно благодаря деятельности С. П. Боткина появилась первая санитарная карета, как прообраз будущей "Скорой помощи" .
Скончался 24 декабря 1889 года в 12 ч 30 мин в Ментоне. Похоронили Боткина на Новодевичьем кладбище. В это время шёл съезд русских врачей, работу которого прервали. Гроб с телом Боткина несли на руках на протяжении 4 вёрст. И.П.Павлов более 10 лет руководил экспериментальной лабораторией в клинике С.П.Боткина. В своем выступлении на заседании Общества русских врачей, посвященном памяти С.П.Боткина, он отметил: «Покойный С.П.Боткин был лучшим олицетворением законного и плодотворного союза медицины и физиологии – тех двух родов человеческой деятельности, которые на наших глазах воздвигают здание науки о человеческом организме и сулят в будущем обеспечить человеку его лучшее счастье – здоровье и жизнь...Я имел честь в продолжении 10 лет стоять близко к деятельности покойного клинициста в ее лабораторной отрасли...Глубокий ум его, не обольщаясь ближайшим успехом, искал ключи к великой загадке: что такое больной человек и как помочь ему – в лаборатории, в живом эксперименте. На моих глазах десятки лет его ученики направлялись им в лабораторию, и эта высокая оценка эксперимента клиницистом составляет, по моему убеждению, не меньшую славу Сергея Петровича, чем его клиническая, известная всей России деятельность». После смерти С.П.Боткина, которого И.П.Павлов считал своим учителем и благодетелем, будущий Нобелевский лауреат впал в тяжелую депрессию и почти в течение года ничем не занимался.
Отец — Пётр Кононович Боткин, купец первой гильдии и владелец крупной чайной фирмы, мать — Анна Ивановна Постникова. В семье родителей С. П. Боткина было 25 детей, Сергей был 11 ребёнком от второго брака отца.
Братья: коллекционер Д. П. Боткин, литератор В. П. Боткин, художник М. П. Боткин. Сестры: М. П. Боткина — жена поэта А. А. Фета
Дети: Александр Боткин (морской офицер), Пётр Боткин (ок. 1865—1937, дипломат), Сергей Боткин, Евгений Боткин (1865—1918, лейб-медик, лечащий врач семьи императора, добровольно погибший вместе с царской семьёй), Виктор Боткин.