Родился и умер в Кортоне, в связи с чем некоторые источники называют его Лука из Кортоны. Ученик Пьеро делла Франческа, он испытал также влияние Антонио Поллайоло в передаче анатомии человека и движения. Работал во многих городах Средней Италии, как в центрах Возрождения, при дворах Лоренцо Медичи во Флоренции и Федериго да Монтефельтро в Урбино, так и в провинциальных.
В 1481—1482 годах принимал участие в оформлении Сикстинской капеллы в Риме, написав совместно с Бартоломео делла Гатта фреску «Сцены из жизни Моисея». В Сикстинской капелле работал в одно время с Перуджино, влияние которого историки искусства отмечают во фресках Сеньорелли, исполненных для сакристии святилища в Лорето, а также в алтаре Святого Онуфрия для собора Перуджи (1484).
Часто бывал во Флоренции, в 1490 году написал для Лоренцо Великолепного знаменитую картину «Воспитание Пана» (погибла в Берлине во время Второй мировой войны) и тондо «Мадонна с младенцем» (Уффици).
Наибольшую известность Синьорелли принесли фрески в монастыре аббатства Монте Оливето Маджоре (Тоскана, 1496—1498) «История Святого Бенедикта» и «Конец мира» для капеллы Сан Брицио собора в Орвьето (1499—1502). Фрески капеллы Сан Брицио, один из самых впечатляющих циклов на тему Апокалипсиса, представляют собой переход к живописи XVI века. В полной мере здесь раскрылся талант Синьорелли — одного из блестящих рисовальщиков Ренессанса. Согласно источникам, Микеланджело вдохновился именно этим произведением, создавая свой «Страшный суд».
В 1512 году был назначен послом Кортоны во Флоренции.
Последние годы жизни провёл в родном городе, где являлся главой мастерской.