Вильгельм Пфеффер родился в семье аптекаря. Под влиянием отца он с раннего возраста интересовался естественными науками и ботаникой. Учился в гимназии, был учеником аптекаря, в 18 лет стал помощником аптекаря.
В 1863 году он поступает в Гёттингенский университет, где изучает химию и фармацевтику. Его преподавателями были известные химики Фридрих Вёлер, Вильгельм Рудольф Фиттиг и физик Вильгельм Эдуард Вебер.
После получения в 1865 году учёной степени, продолжает изучение фармацевтики в Марбургском университете. В 20 лет он имел учёную степень доктора философии.
В 1871 году, в качестве приват-доцента, начал чтение лекций в Марбурге.
Был профессором ботаники в Бонне (с 1873 года), Базеле (недолго) и Тюбингене (с 1878 года).
C 1887 года занимал кафедру в Лейпциге.
Первые научные исследования Пфеффера были посвящены географии и эмбриологии растений.
В 1868 была опубликована «Bryologische Reisebilder aus dem Adula», в 1869 — «Bryogeographische Studien aus den Betischen Alpen» и «Zu Bl?thenentwickelung der Primulaceen und Ampelideen».
Но очень скоро, под влиянием знаменитого Сакса, у которого он работал в Вюрцбурге, Пфеффер перешёл на физиологические вопросы и с тех же пор уже исключительно работал в этой области.
Много весьма важных результатов достигли исследования Пфеффера по вопросам раздражимости и движения растений: «Ueber das Oeffnen und Schliessen der Bl?then» (1872), «Die periodischen Bewegungen der Blattorgane» (1875), «Zur Kenntniss der Contactreize» и др. В особенности его исследования над движениями низших организмов: «Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize», а также ряд работ, сделанных под его руководством его учениками. Вместе с исследованиями Дарвина эти работы являются основными в данном вопросе.
Огромная заслуга принадлежит Пфефферу в изучении обмена веществ (в узком смысле слова) и превращения энергии в растениях. Важные его работы посвящены осмосу и его роли в дыхании и питании растений. Здесь особенно важны его сочинения: «Osmotische Untersuchungen» (1877), «Ueber die Aufnahme und Ausgabe ungel ?ster K?rper», «Zur Kenntniss der Plasmahaut und der Vacuolen etc.» (1890); «Studien zur Energetik der Pflanzen» (1892), «Druck und Arbeitsleistung durch wachsende Pflanze» (1893) и др.
В 1881 вышло его двухтомное сочинение «Pflanzenphysiologie. Ein Handbuch d. Lehre vom Stoffwechsel und Kraftwechsel in der Pflanzen», замечательное как полнотой изложения предмета, так и глубиной и всесторонностью анализа вопросов.
Под руководством Пфеффера работал ряд ботаников всех стран, в том числе немало русских. Под его редакцией изданы два тома «Untersuchungen aus dem botanischen Institut zu T?bingen», состоящие исключительно из работ его учеников и его собственных.
С 1896, после смерти Прингсгейма, Пфеффер совместно с Эдуардом Страсбургером продолжал издание журнала «Jahrb?cher f?r wissenschaftliche Botanik».