Тосиро Мифунэ родился в Циндао, Китайская Республика, в семье японцев. Его отец Токудзо Мифунэ был коммерсантом и владельцем фотоателье. Тосиро рос в Даляне, куда его семья переехала в 1925 году, у него было два брата. В юности он работал в фотоателье своего отца. Хотя до девятнадцати лет он жил в Китае, но как японский гражданин был призван в армию Японии, где служил в ВВС в отделе аэрофотосъёмки.
В 1946 году Мифунэ демобилизовался и приехал в Токио. Он поступил на работу в кинокомпанию «Тохо» как помощник оператора. В это время из кинокомпании после длительной забастовки ушла большая группа актёров, и она организовала конкурс по поиску «новых лиц», в котором участвовало 4000 человек. Мифунэ привлёк внимание режиссёра Кадзиро Ямамото. На этом же конкурсе Мифунэ познакомился с актрисой Сатико Ёсиминэ, которая в 1950 году станет его супругой.
Первые фильмы с участием Мифунэ вышли в том же 1947 году — «Время новых дураков» Кадзиро Ямамото и «По ту сторону серебряного хребта» Сэнгити Танигути.
На съёмках второго фильма он познакомился с Акирой Куросавой. В 1948 году вышел фильм Куросавы «Пьяный ангел», где Мифунэ сыграл главную роль — молодого гангстера Мацунагу. С этого фильма началось многолетнее сотрудничество актёра и режиссёра. Международная слава пришла к ним обоим после фильма «Расёмон» (1950) по рассказу классика японской литературы Акутагавы Рюноскэ «В чаще». Мифунэ сыграл разбойника Тадзёмару.
В 1951 году Куросава экранизировал роман Достоевского «Идиот», перенеся сюжет в Японию. Мифунэ сыграл в этом фильме японский вариант купца Рогожина. «Семь самураев» (1954) стал одним из самых важных фильмов в творчестве как Мифунэ, так и Куросавы. В истории о том, как семь бедных самураев защищают деревню от бандитов, Мифунэ сыграл роль самурая-самозванца Кикутиё.
Мифунэ много снимался и у других режиссёров. В частности, он трижды воплотил в кино образ легендарного фехтовальщика Миямото Мусаси. Первый фильм трилогии «Самурай: Путь воина» вышел в 1954 году, продолжения последовали в 1955 и 1956 годах.
Выходили новые фильмы творческого тандема Куросава — Мифунэ: «Трон в крови» (1957; по пьесе Шекспира «Макбет»), «На дне» (1957; по одноимённой пьесе Максима Горького), «Три негодяя в скрытой крепости» (1958), «Телохранитель» (1961; по роману Дэшила Хэммета «Кровавая жатва»). В 1962 году актёр основал кинокомпанию «Мифунэ Продакшн» (Mifune Production), существующую по сей день.
Последней совместной работой Куросавы и Мифунэ стала драма «Красная борода» (1965). Личные разногласия разрушили тандем, пути актёра и режиссёра разошлись: Мифунэ продолжал эксплуатировать образ самурая, а Куросава отклонился от этой тематики.
С начала 1960-х Мифунэ активно снимается в европейском и американском кино. В вестерне Теренса Янга «Красное солнце» (1971) Мифунэ играет самурая из свиты японского посла, а его партнёры по фильму — Чарльз Бронсон и Ален Делон — бандитов с Дикого Запада. В 1979 году он снимается в роли командира японской подлодки в сатирической комедии Стивена Спилберга «1941», а в 1980 году — в пятисерийном фильме «Сёгун», где снова воплощает образ самурая в роли даймё Торанаги. Джордж Лукас хотел пригласить Мифунэ для исполнения роли Оби-Вана Кеноби в четвёртом эпизоде «Звёздных войн».
В 1992 году у Мифунэ обнаружились проблемы с сердцем. После этого он практически перестал сниматься в кино. Актёр умер в 1997 году. Похороны были организованы совместно кинокомпаниями «Тохо», Mifune Production и Kurosawa Production.
Британский институт кино называет Тосиро Мифунэ «самым известным японским актёром в западном мире». За свою жизнь он был удостоен множества наград, включая приз Венецианского кинофестиваля.
В 1997 году журнал Empire включил Мифунэ в список ста лучших киноактёров всех времён; а в 2006 году его роль в фильме «Телохранитель» попала в список ста величайших ролей всех времён, составленный журналом Premiere.