Родился в Нью-Йорке в семье Эллы (Квинлан) О’Нил и известного американского актёра Джеймса О’Нила. Учился в католической школе-интернате в Нью-Йорке, затем в школе в Нью-Лондоне. В 1902 году поступил в интернат для протестантов и католиков в Коннектикуте. В 1906 году поступил в Принстонский университет, но через год бросил учёбу. В 1909 году женился против воли отца и отправился золотоискателем в Гондурас, затем в Англию и Аргентину, где бродяжничал и нищенствовал. в 1911 году возвратился в Нью-Йорк. В 1912 году начал писать пьесы. С 1914 году стал посещать семинар Дж. П. Беккера по драматургии в Гарвардском университете. В 1916 году состоялась первая постановка пьесы О'Нила («К востоку, на Кардифф»). С 1920 года его пьесы начинают ставить на Бродвее. С 1920 по 1923 год драматург потерял отца, мать и брата, в 1928 году развелся со второй женой. В 1929 году женился в третий раз на актрисе Карлотте Монтрей. В 1920-1943 году создал более 20 пьес. В 1936 году драматург был удостоен Нобелевской премии по литературе. В 1943 году полностью утратил работоспособность из-за поражения нервной системы.
В 2011 году пьеса "Экзорцизм" (1920), написанная по мотивам попытки суицида и считавшаяся утерянной, была найдена в частных архивах, выкуплена и хранится теперь в библиотеке Йельского университета.