Уильям «Уиллем» Дефо родился 22 июля 1955 года в городе Эпплтон, штат Висконсин. Изучал драматическое искусство в университете Милуоки (University of Wisconsin-Milwaukee), не доучившись, отправился в гастроли с авангардным театром «Theatre X». После четырёх лет гастролей по США и Европе, обосновался в Нью-Йорке и стал членом театральной труппы «The Performance Group».
Первую роль сыграл в 1980 году в фильме Майкла Чимино «Врата рая», однако кадры с его участием были вырезаны. После снялся в фильмах «Нелюбимый» Кэтрин Бигелоу и «Жить и умереть в Лос-Анджелесе» (1985) Уильяма Фридкина.
За роли в фильмах «Взвод» Оливера Стоуна и «Тень вампира» Э. Элиаса Мериджа, был номинирован на «Оскар» как лучший актёр второго плана.