Василий Поленов родился в многодетной, культурной дворянской семье 20 мая (1 июня) 1844 года в Петербурге.
Его отец, Дмитрий Васильевич Поленов, был известным археологом и библиографом. Мать, Мария Алексеевна, урожденная Воейкова, писала книги для детей, занималась живописью. Дядя художника, М.В.Поленов, был сенатором.
Ярким детским впечатлением Поленова были поездки на север, в Олонецкий край с его девственной природой, и в Ольшанку Тамбовской губернии, в имение бабушки В.Н. Воейковой. Вера Николаевна, дочь известного архитектора Н.А. Львова, воспитанная после ранней смерти родителей в доме Г.Р. Державина, хорошо ориентировалась в русской истории, знала народную поэзию, любила рассказывать внукам русские народные сказки, былины, предания. В этой атмосфере сформировался художественный вкус Поленова. Воейкова всячески развивала увлечение внуков живописью, поощряла творческое честолюбие, устраивала среди детей конкурсы, присуждая, как в академиях, за лучшую работу «медаль».
Наиболее одаренными среди детей Поленовых оказались двое: старший сын Василий и младшая дочь Елена, ставшие впоследствии настоящими художниками. Детям были наняты педагоги по живописи из Академии художеств. Встреча с наставником П. П. Чистяковым стала судьбоносной для таланта Поленова. Чистяков обучал рисунку и основам живописи Поленова и его сестру в 1856-1861 годах, сам будучи ещё студентом Академии художеств. С самых первых занятий преподаватель требовал от учеников пристального изучения натуры.
Учился в петрозаводской гимназии, по окончании курса записался в ученики Императорской Академии Художеств.
В 1863 году Поленов, окончив гимназию, поступает вместе со своим братом Алексеем на физико-математический факультет Петербургского университета. По вечерам Поленов в качестве вольноприходящего ученика посещает Академию художеств. Занимается не только в рисовальных классах, попутно слушает лекции по анатомии, строительному искусству, начертательной геометрии, истории изящных искусств. Не бросает и занятий музыкой, сам пишет произведения. Поленов был постоянным посетителем оперного театра и концертов, увлекался музыкой Вагнера, сам пел в студенческом хоре Академии.
Вскоре Поленов становится постоянным учеником натурного класса Академии художеств. Затем на время оставляет университет, полностью погрузившись в занятия живописью. В 1867 году заканчивает ученический курс в Академии художеств и получает серебряные медали за рисунки и этюд. Вслед за этим участвует в двух конкурсах на золотые медали по избранному им классу исторической живописи. С января 1868 года вновь становится студентом университета, но теперь уже юридического факультета.
Первую зарубежную поездку Поленов совершает летом 1867 года, он едет во Францию, где посещает Всемирную выставку. В экспозиции был большой раздел с произведениями народных художественных промыслов различных стран. Незабываемые впечатления от увиденного легли в основу диссертации, которую Поленов защитил в университете.
В 1869 году за картину «Иов и его друзья» Поленов получил малую золотую медаль, а в 1871 году (одновременно с Ильёй Репиным) за конкурсную работу «Христос воскрешает дочь Иаира» — большую золотую медаль.
Окончив одновременно университетский курс по юридическому факультету в 1872 году, Поленов отправился за границу в качестве пенсионера академии. Посетил Вену, Мюнхен, Венецию, Флоренцию и Неаполь, длительное время жил в Париже и написал там в числе прочего картину «Арест графини д’Этремон», обеспечившую ему в 1876 году звание академика.
Возвратившись в том же 1876 году в Россию, вскоре отправился на русско-турецкую войну, в продолжение которой состоял официальным художником при главной квартире наследника-цесаревича (впоследствии императора Александра III).
С 1870-х Поленов много работал в области театрально-декорационной живописи. В 1882—1895 годах художник преподавал в Московском училище живописи, ваяния и зодчества, где в числе его учеников были И. И. Левитан, К. А. Коровин, И. С. Остроухов, А. Е. Архипов, А. Я. Головин и Е. М. Татевосян.
В 1877 Поленов поселился в Москве. Спустя год на VI передвижной выставке Поленов показывает ставшую впоследствии его визитной карточкой картину «Московский дворик», написанную с натуры в арбатском переулке. После её оглушительного успеха художник становится родоначальником нового жанра — «интимного пейзажа». С 1879 года состоял членом Товарищества передвижных художественных выставок. Приобретает славу мастера эпического пейзажа, которую затем преумножит, поселившись на Оке и совершив путешествия по местам, связанным с колыбелью христианства.
В 1881—1882 отправляется в своё первое путешествие на Ближний Восток и по библейским местам: в Константинополь, Палестину, Сирию и Египет, откуда привозит эскизы и наброски к масштабному полотну «Христос и грешница», а также другие картины, написанные в найденной Поленовым в поездке новой для себя манере письма.
Будучи от рождения городским жителем, Поленов очень любил ширь бескрайних полей, широколиственные густые леса, спускающиеся к могучим рекам. Мечтал поселиться на лоне природы. В 1890 приобрёл небольшое имение Бёхово в Тульской губернии, на высоком берегу над Окой. В тихом месте, в сосновом бору, чуть в стороне от села построил дом по собственному оригинальному проекту, и при доме художественные мастерские. Усадьба была названа Борок. Там Поленов много и продуктивно работал, охотно приглашал к себе сельских детей, проводил для них познавательные занятия и представления, развивал художественный вкус. По замыслу Поленова, усадьба должна была стать «гнездом художников», а со временем превратиться в первый провинциальный общедоступный музей. Поленов построил народный театр для крестьян и церковь в Бёхове.
В настоящее время в усадьбе Борок (современное название Поленово) находится Государственный мемориальный историко-художественный и природный музей-заповедник В.Д.Поленова, где сохранилась уникальная обстановка, интерьер, мебель, библиотека и предметы быта хозяина. Его первым директором был сын художника, биолог, профессор Московского университета Дмитрий Васильевич Поленов (1886—1967).
В 1899 во второй раз отправился на Ближний Восток с целью сбора материала для грандиозной евангельской серии «Из жизни Христа», которую завершил в 1909. Выставка этих картин имела большой успех и на момент экспозиции стала центральном событием в мире живописи.
В 1910—1918 годах Поленов вёл в Москве просветительскую деятельность, участвовал в организации народного театра.
В 1906 — в Большом зале Московской консерватории исполнена опера Поленова «Призраки Эллады».
В 1914 в Москве устраивается выставка картин цикла «Из жизни Христа» для сбора средств в пользу раненых в Первой мировой войне.
В 1915 — по проекту Поленова в Москве на Пресне строится дом для Секции содействия фабричным и деревенским театрам; с 1921 года это Дом театрального просвещения имени академика В. Д. Поленова.
В 1924 прошла первая персональная выставка в Государственной Третьяковской галерее, посвящённая 80-летию художника.
В 1926 Поленову присвоено звание народного художника РСФСР.
Поленов очень любил лето, а длинные июльские дни, когда берёза достигает полного листа, называл «центральными» в году. Именно в такой день, будучи в глубоко преклонном возрасте, он и ушёл из жизни.
Художник скончался 18 июля 1927 года в своей усадьбе и был похоронен на сельском кладбище в селе Бёхово на крутом берегу Оки, где он так часто любил рисовать этюды. Над его могилой, согласно завещанию, установлен олонецкий крест. В имении Имоченцы Олонецкой губернии 10-летний городской житель Вася Поленов когда-то впервые близко познакомился с природой.
В.Д.Поленов был женат с 1882 на Наталье Васильевне Якунчиковой (1858—1931), дочери московского купца и промышленника В.И.Якунчикова. От этого брака родилось шесть детей: двое сыновей (один из которых, Федя, умер во младенчестве) и четыре дочери.
«Бабушкин сад»
«Московский дворик»
«Цезарская забава»
«Христос и грешница»
«Заросший пруд»
Василий Щеголенок
«Аббатство» в Поленове