Василий Иванович Фребелиус родился в столице Российской империи городе Санкт-Петербурге в семье знаменитого каретного мастера Иоганна Фребелиуса. Получил среднее образование в известной немецкой школе — St.Petri-Schule. С 1832 по 1838 г. он изучал медицину в Дерптском университете, а затем несколько лет работал в клиниках Парижа, Вены, Праги и Берлина, занимаясь преимущественно хирургией и офтальмологией и усвоив все новые способы лечения, вводившиеся в то время знаменитым преобразователем офтальмологии, берлинским профессором Грефе.
Первые сообщения в России об офтальмоскопических исследованиях (1857) связаны с именем Ф.; он же произвел здесь первую иридектомию при глаукоме (1857). В 1864 г. Ф. был назначен главным врачом СПб. Воспитательного дома, в котором уже с 1847 г. состоял ординатором глазного отделения больницы. Его стараниям Воспитательный дом обязан учреждением в 185 году прозектуры — первой больничной прозектуры в России; В. И. Фребелиус первый стал созывать врачей своего госпиталя на регулярные конференции для обсуждения медицинских вопросов; благодаря ему стали выходить в свет отчеты по Воспитательному дому; наконец, по его почину учрежден в 1868 году при СПб. Воспитательном доме институт для привития телячьей оспенной лимфы. Главный его труд - атлас офтальмоскопии, над которым он много трудился, остался ненапечатанным; его многочисленные статьи, преимущественно по офтальмологии, печатались в Петербурге и заграничных журналах, а также выходили отдельными брошюрами.