Родился в семье поручика резервного пехотного полка в Чернигове, дослужившегося до чина капитана и умершего в 1902. В 1901 будущий глава военного ведомства окончил Воронежский кадетский корпус и поступил в Николаевское инженерное училище, однако отказался присягать «на верность царю и отечеству», объясняя это «органическим отвращением к военщине», и после ареста был выпущен. В 1902 ушёл из дома, некоторое время работал чернорабочим и извозчиком, после чего поступил в юнкерское училище в Петербурге, где присягу все-таки принял. Однако верность ей подпоручик сохранять не стал: во время русско-японской войны Овсеенко дезертировал из своей части и занялся революционной работой.
Антонов-Овсеенко участвовал в левосоциалистическом крыле революционного движения с 1901, когда он вступил в социал-демократический студенческий кружок в Варшаве. Весной 1902 отправился в Санкт-Петербург, где работал сначала чернорабочим в Александровском порту, а затем кучером в «Обществе покровительства животным». В конце 1902 через болгарского революционера Бориса Спиридоновича Стомонякова, будущего заместителя наркома иностранных дел в Советской России, стал членом РСДРП и создал революционную организацию в пехотном Владимирском военном училище в Петербурге, где он был юнкером. В 1904 окончил Владимирское военное училище и был распределён в Колыванский 40-й пехотный полк, дислоцировавшемся в Варшаве, где основал Варшавский военный комитет РСДРП. Во время Первой русской революции в 1905 пытался организовать восстание. Был арестован, но вскоре освобождён. Стал членом Петербургского комитета РСДРП. В 1906 пытался организовать восстание в Севастополе, за что был вновь арестован, приговорён к смертной казни, с заменой 20 годами каторги. Бежал в Финляндию, затем нелегально действовал в Петербурге. В 1910 эмигрировал во Францию, где примыкал к эмигрантам-меньшевикам, однако после начала Первой мировой войны (1914) выступил против империалистической войны и порвал с ними, став меньшевиком-интернационалистом. Февральская революция позволила Антонову-Овсеенко в июне 1917 вернуться в Россию и вступить в партию большевиков.
Будучи членом Военной организации при ЦК РСДРП(б), был направлен в Гельсингфорс (Хельсинки) для ведения агитационной работы среди солдат Северного фронта и моряков Балтийского флота, параллельно редактируя газету «Волна». Один из наиболее активных участников Всероссийской конференции фронтовых и тыловых организаций РСДРП(б), проводившейся в июне 1917, Антонов-Овсеенко принял непосредственное участие в организации Июльского восстания большевиков. После Июльского кризиса арестован Временным правительством и заключён в петроградскую тюрьму «Кресты», где совместно с Фёдором Фёдоровичем Раскольниковым от имени арестованных большевиков составил письменный протест против необоснованного ареста. После последовавшего освобождения под залог (4 сентября) Центробалт назначил Антонова-Овсеенко комиссаром при генерал-губернаторе Финляндии.
Делегат Всероссийского демократического совещания и Второго съезда моряков Балтфлота (сентябрь-октябрь 1917), на котором огласил текст воззвания «К угнетённым всех стран». 30 сентября избран в состав Финляндского областного бюро РСДРП(б). Член Организационного комитета и Исполкома съезда Советов Северной области. Участвовал в работе конференции военных организаций РСДРП(б) Северного фронта 15 октября, от которого избран в Учредительное собрание. В своём докладе на заседании Петроградского Совета РСД 23 октября отметил, что гарнизон в целом выступает за установление власти Советов, красногвардейцы заняли оружейные заводы и склады и укрепили внешнее кольцо обороны Петрограда, парализовав действия штаба Петроградского военного округа.
Владимир Александрович Антонов-Овсеенко в качестве секретаря Петроградского Ревкома принимал активное участие в Октябрьском вооружённом восстании в Петрограде. Джон Рид в книге «Десять дней, которые потрясли мир» вспоминал: «В одной из комнат верхнего этажа сидел тонколицый, длинноволосый человек, математик и шахматист, когда-то офицер царской армии, а потом революционер и ссыльный, некто Овсеенко, по кличке Антонов». Именно он возглавлял красногвардейцев, революционных солдат и матросов во время штурма Зимнего дворца, после чего арестовал Временное правительство. На проводившемся параллельно II Всероссийском съезде Советов 26 октября (8 ноября) 1917 Антонова-Овсеенко избрали членом Комитета по военным и морским делам при Ленинском Совнаркоме.
Как специалист в области военного дела в декабре 1917 Владимир Александрович Антонов-Овсеенко принял командование над красными войсками на юге страны, воевавшими с казаками атамана Каледина и частями Украинской армии, поддерживающими Украинскую Центральную раду. Во главе южной группы войск Советской России Антонов-Овсеенко вступил в Харьков, где съезд Советов провозглашает советскую власть на Украине, после чего передал командование войсками, дислоцированными на Украине, левому эсеру Муравьёву, а сам возглавил борьбу против казачьих войск в качестве командующего советскими войсками Юга России (март-май 1918).
В числе прочего, по личному указанию Антонова-Овсеенко 1 апреля 1918 года в Таганроге был расстрелян отставной генерал Русской Императорской армии П. Ф. Ренненкампф.
После отхода немецких войск Антонов-Овсеенко, будучи с января по июнь 1919 командующим Украинским фронтом, а позже и наркомом военных дел УССР, принял активное участие в военных действиях против армии Украинской народной республики и восстановлении советской власти практически на всей территории Украины. Активно привлекался и к решению вопросов социально-экономического характера: так, когда владельцы харьковских предприятий отказались выплатить рабочим заработную плату, протестуя против введения 8-часового рабочего дня, Антонов-Овсеенко посадил 15 капиталистов в вагон поезда и потребовал миллиона наличными, угрожая в противном случае отправить их на работу в рудники.
Антонов-Овсеенко активно участвовал в подавлении Тамбовского восстания. В 1919—1920 он пытался бороться с народным недовольством на посту председателя исполкома Тамбовской губернии, а в 1921 — получил чрезвычайные полномочия председателя комиссии ВЦИК по борьбе с бандитизмом в Тамбовской губернии и активно содействовал Михаилу Тухачевскому в подавлении Красной Армией антибольшевистского восстания крестьян в Тамбовской губернии, известного в советской историографии как «Антоновщина». Вместе с Тухачевским он разработал меры по жестокому подавлению непокорных крестьян: семьи восставших брались в заложники и отправлялись в концлагеря; за укрытие повстанцев или их близких расстреливался старший в укрывшей семье; согласно особому приказу расстреливался всякий, кто отказался назвать свое имя.
В 1920 году у него родился сын Антон — в будущем известный российский историк и публицист.
В ходе Гражданской войны Антонов-Овсеенко стал опытным партийным функционером, и его навыки помогли ему стать в 1922—1924 начальником Политуправления РВС республики. Он активно выступал против усиления власти Сталина. Поэтому Владимир Александрович поддержал Льва Троцкого, с которым у него наладились хорошие отношения, и примкнул (в 1923-27) к Левой оппозиции, в 1928 под давлением был вынужден порвать с ней. В это время он занимал должности полпреда в ряде восточноевропейских стран, включая Чехословакию (с 1924), Литву (с 1928) и Польшу (с 1930). В 30-е годы ему на некоторое время было разрешено работать на разнообразных должностях, связанных с юриспруденцией, включая должности прокурора РСФСР (с 1934) и наркома юстиции РСФСР (с 1937). В должности прокурора РСФСР Овсеенко способствовал установлению практики вынесения приговоров «по пролетарской необходимости».
Во время Гражданской войны в Испании был генеральным консулом СССР в Барселоне (1936—1937): через этот город проходило большинство военных грузов из СССР для испанских коммунистических формирований. Оказал большую помощь республиканским войскам как военный советник. Сборник документов, условно названный «Дневником Антонова-Овсеенко», свидетельствует о том, что он пытался выступать в защиту оппозиционных сталинской линии анархо-синдикалистов и марксистов из ПОУМ, контролировавших антифашистское движение в Каталонии, за что был назван Хуаном Негрином «большим каталонцем, чем сами каталонцы». После возникшего конфликта с советским генеральным консулом Негрин даже собирался подать в отставку.
В конце 1937 Антонов-Овсеенко был отозван из Испании, после чего арестован НКВД в ходе кампании Большого террора в СССР 12 октября 1937.
А. Ракитин пишет: «...поздний вечер 11 октября 1937 г. Кинорежиссер С. Васильев никак не расстанется с Владимиром Александровичем: уж очень интересные подробности рассказывает герой Октября. Постановщику фильма "Ленин в Октябре" М. Ромму разрешено показывать на экране только Ленина, Сталина, Дзержинского и Свердлова. Такова воля самого Сталина. Антонов-Овсеенко знает об этом. Знает, но консультирует создателей фильма. Так же, как он делал это для редакции "Истории гражданской войны", книги, из которой его имя также вычеркнули. ...Васильев ушел поздно ночью. А через полчаса Антонова-Овсеенко арестовали». Отметим, что во втором («дополненном») издании цитируемой книги (1973) этот сюжет изъят. Почти одновременно была арестована его жена («знала о террористической деятельности своего мужа»). Их расстреляли в один день.
8 февраля 1938 приговорён ВКВС СССР к расстрелу «за принадлежность к троцкистской террористической и шпионской организации». Расстрелян 10 февраля 1938 года в Бутырской тюрьме (?), похоронен на полигоне «Коммунарка».
Сокамерник Антонова вспоминал: "Когда его вызвали на расстрел, Антонов стал прощаться с нами, снял пиджак, ботинки, отдал нам и полураздетый ушел на расстрел". 21 год назад, в шляпе набекрень, с волосами до плеч, он объявил низложенным Временное правительство. Теперь его босого вели к расстрельной камере.
По словам сына Михаила Томского Юрия, которые воспроизводят Джузеппе Боффа и Роберт Конквест, перед смертью Антонов-Овсеенко произнёс слова: «Я прошу того, кто доживет до свободы, передать людям, что Антонов-Овсеенко был большевиком и остался большевиком до последнего дня».
Реабилитирован посмертно 25 февраля 1956 года.
В честь В. А. Антонова-Овсеенко названы улицы в Самаре, Воронеже, Москве (Пресненский район), Санкт-Петербурге (Невский район), Киеве. В Чернигове, на Аллее Героев, установлен бюст Антонова-Овсеенко.
Также Антонов-Овсеенко упоминается как близкий друг Максима Исаева в произведении Юлиана Семёнова «Приказано выжить».
1932—1937 : Новинский бул., д.25 кор.1 (Дом Наркомфина), кв. 49