Закончил Институт инженеров путей сообщения (1830), где более 30 лет преподавал математику, физику, физическую географию и высшую геодезию. Работал в Горном институте, во Втором кадетском корпусе. В 1840-х гг. возглавлял Комиссию по устройству в России электромагнитного телеграфа, по его настоянию в России была принята азбука Морзе. В 1860-х гг. работал в Департаменте неокладных сборов, возглавлял Экспедицию для поверки ввозимых в Россию спиртометров.
С 1865 по 1892 — ученый хранитель Депо образцовых мер и весов.
Разработал программу развития отечественной метрологии и поверочного дела. Инициатор создания в 1869 г. правительственной комиссии для преобразования Депо образцовых мер и весов. В. С. Глухов определил функции Депо как государственного поверочного органа, в ведении которого должны находиться все измерительные приборы, используемые для поверки мер и весов. Проект закона о мерах и весах предусматривал применение в качестве основной единицы длины — аршина, вместо сажени, а также более точное определение основной единицы массы — фунта. Предполагалось возобновление прототипов (эталонов) длины и массы и факультативное применение в России метрической системы мер наряду с русской системой.
Произвел сличение различных мер длины и массы, организовал первые в России метрологические работы по термометрии и способствовал усовершенствованию оборудования Депо образцовых мер и весов.
Многие идеи В. С. Глухова получили дальнейшее развитие и были осуществлены Д. И. Менделеевым в Главной палате мер и весов.