Родился в семье прокурорского работника.
1968—1972 — токарь на Кореновском сахарном заводе (Краснодарский край).
1972—1974 — служба в армии.
1978 — окончил Харьковский юридический институт.
1978—1983 — стажёр, помощник, старший помощник прокурора Кореновского района Краснодарского края.
С 1983 — заместитель прокурора Динского района, затем прокурор Гулькевичского района Краснодарского края.
С 1985 — прокурор Хостинского района Сочи, с 1992 — прокурор Сочи.
С 1994 — первый заместитель прокурора Краснодарского края.
15 октября 1997 — назначен заместителем генерального прокурора РФ.
Июнь 1998 — апрель 1999 — начальник главного управления Генпрокуратуры по надзору за исполнением законов по федеральной безопасности и межнациональным отношениям на Северном Кавказе, глава координационного совета правоохранительных органов субъектов Северо-Кавказского региона.
6 апреля 1999 — переведён в Москву.
29 июля 1999 — назначен и. о. генерального прокурора РФ.
17 мая 2000 — утверждён в должности Советом федерации. 13 апреля 2005 повторно утверждён в должности по представлению президента Путина.
При Владимире Устинове Генпрокуратура сыграла исключительную роль в перераспределении собственности. Первым в июле 2000 года Россию покинул Владимир Гусинский. Тогда же активизировалось следствие в отношении Бориса Березовского, и в октябре 2000 года он уехал в Великобританию. В июне 2003 с возбуждения уголовного дела по факту незаконной приватизации ОАО «Апатит» Генеральная прокуратура начала наступление на нефтяную компанию ЮКОС. 2 июля 2003 был задержан руководитель МФО МЕНАТЕП Платон Лебедев, 25 октября — председатель правления ЮКОСа Михаил Ходорковский. В 2005 году оба были осуждены. Совладельцам ЮКОСа Леониду Невзлину, Владимиру Дубову и Михаилу Брудно удалось покинуть страну. ЮКОСу были предъявлены колоссальные налоговые претензии, что привело к утрате основного нефтедобывающего актива, банкротству и введению внешнего наблюдения. Деятельность генпрокуратуры, поддержанная Владимиром Путиным, заставила остальных крупных бизнесменов стать лояльными к государству.
23 августа 2000 года — Устинов возглавил расследование гибели подводной лодки «Курск». Позднее он выпустил книгу «Правда о „Курске“».
2001 — Устинов оказал успешное противодействие тогдашнему заместителю руководителя администрации президента РФ Дмитрию Козаку, который предложил лишить прокуратуру следственных функций, оставив ей только надзорные функции.
15 ноября 2001 года — лично возглавил группу государственных обвинителей в процессе над чеченским полевым командиром Салманом Радуевым. 25 декабря Радуев был приговорён к пожизненному заключению и уже через год умер в колонии.
2005 — Генеральная прокуратура смогла добиться выдачи из швейцарской тюрьмы бывшего руководителя Минатома Евгения Адамова, помешав таким образом его передаче американскому правосудию и потенциальному разглашению российских ядерных секретов. В то же время западные государства неоднократно отказывались экстрадировать в Россию участников громких уголовных дел — Бориса Березовского (Великобритания в сентябре 2003 года и Латвия в феврале и сентябре 2005 года), Владимира Гусинского (Испания в апреле 2001 года и Греция в октябре 2003 года), совладельцев ЮКОСа (Израиль и Великобритания), высокопоставленных представителей Чеченской Республики Ичкерия Ахмеда Закаева (Великобритания) и Ильяса Ахмадова (США).
2006 — с подачи Генпрокуратуры Госдума приняла в первом чтении законопроект о восстановлении института конфискации имущества.
2 июня 2006 года президент России Владимир Путин внёс в Совет федерации представление об освобождении Устинова от занимаемой должности с официальной формулировкой «по собственному желанию».
23 июня 2006 Владимир Устинов был назначен министром юстиции Российской Федерации (ранее занимавший этот пост Юрий Чайка за несколько дней до этого был назначен генеральным прокурором).
В 2006 году доход чиновника составил 5,5 млн рублей.
14 мая 2008 был назначен Полномочным представителем Президента Российской Федерации в Южном федеральном округе.
В 2003 защитил докторскую диссертацию на тему борьбы с терроризмом.
Действительный государственный советник юстиции, заслуженный юрист Российской Федерации. Закончил Дипломатическую академию МИД РФ.
Женат, имеет сына и дочь. Сын Устинова Дмитрий в ноябре 2003 женился на Инге, дочери заместителя руководителя администрации президента РФ Игоря Сечина и на сентябрь 2007 года Дмитрий работает в администрации президента РФ.
За пять лет пребывания Владимира Устинова в должности генерального прокурора в центре деятельности российской прокуратуры находилось расследование дел, связанных с терроризмом и сепаратизмом на Северном Кавказе.
Кроме того, большой общественный резонанс получило возбуждение и расследование уголовных дел против бизнесменов, проявивших нелояльность исполнительной власти, что приводило к банкротству подконтрольных им компаний или их переходу под контроль государства.
Устинов сумел сохранить статус Генеральной прокуратуры, несмотря на попытки изъять у прокуратуры следственные подразделения и подчинить её Министерству юстиции.
Многие просьбы Генеральной прокуратуры РФ о выдаче российских граждан, направлявшихся иностранным государствам, не были выполнены в связи с подозрениями в политическом характере предъявляемых им обвинений.
Анализируя неожиданную отставку Устинова и пытаясь понять её причины, наблюдатели указывают на резко выросшую в начале 2006 года политическую активность Генеральной прокуратуры и усилении одной из группировок в российском руководстве, в которую входили Владимир Устинов, его свойственник Игорь Сечин и премьер Михаил Фрадков, — это так называемая группировка «силовиков».
Отмечали также исключительную активность Генпрокуратуры — задержания работников таможенных органов, наложение ареста на 25 % привилегированных акций компании «Транснефть», арест и предъявление обвинения губернатору Ненецкого автономного округа Алексею Баринову, заявление Устинова с высокой трибуны о том, что вся российская жизнь охвачена коррупцией и находится под контролем организованной преступности. «Организованная преступность поразила практически все сферы — политическую, экономическую, социальную. Преступность всё больше наглеет, всё больше проникает в те же государственные и правоохранительные органы», — заявил Устинов на координационном совещании руководителей правоохранительных органов в мае 2006.
Ещё более запутало ситуацию известие о назначении Владимира Устинова министром юстиции.