В 1560 году Станислав Замойский отправил сына за границу для окончания образования. Побывав в Париже и Страсбурге, Ян отдался в Падуе усердному изучению латинского языка и юриспруденции. Результатом его занятий было сочинение «De Senatu Romano». По всей вероятности, во время пребывания в Италии в его религиозных убеждениях начал совершаться переворот, который вскоре привёл его к переходу в католицизм. Вернувшись в отечество, он поступил секретарем в королевскую канцелярию, привёл в порядок государственный архив и имел случай основательно познакомиться при этом с государственными законами Польши, а также с разными важными политическими документами. Во время междуцарствия 1572 года Замойский начал играть роль на съездах и сеймах.
По избрании на польский престол королем Генриха Анжуйского в числе послов к нему был отправлен и Замойский, бывший в то время старостою белзским. Ему удалось снискать расположение Генриха, пожаловавшего ему богатое Кнышинское староство. Во время второго междуцарствия Ян Замойский стал во главе партии пястовцев, то есть желавших избрания в короли поляка. Переход его в ряды сторонников избрания Стефана Батория объясняется тем, что польская корона отдавалась последнему под условием женитьбы на сестре покойного короля Сигизмунда-Августа — Анне, единственной тогда представительнице прежнего польского королевского дома. Имя Замойского тесно связано с царствованием Батория, для которого он был неоценимым помощником по своей энергии, нелюбви к магнатам и большой популярности среди шляхты.
Новый король поспешил сделать Замойского вице-канцлером, а потом канцлером и коронным гетманом. Замойский пользовался теперь небывалой в Польше властью и значением. К тому же он породнился с самим королем, вступив в третий брак с племянницею Батория, Гризельдою (1583). Замойский был душою всех проектов внутренних преобразований в Польше, а также принимал деятельное участие в военных походах Батория. Со смертью Стефана Батория положение Яна Замойского сделалось трудным, так как он имел массу врагов среди магнатов; в особенности ненавидели его Зборовские. Тем не менее ему удалось в третье междуцарствие провести избрание Сигизмунда, королевича шведского, происходившего по матери от Ягеллонов; избранного другою партией в короли польские эрцгерцога австр. Максимилиана Замойский разбил в битве при Бычине (1588) и взял в плен.
С первой же встречи с Сигизмундом III Замойский почувствовал к нему антипатию и вскоре совсем от него отдалился. Внешней политике короля, находившегося под влиянием Австрии, Замойский не только не сочувствовал, но, считая её пагубною для Польши, насколько был в силах, противодействовал. С своей стороны, король мешал Яну Замойскому в проведении его планов. Проекты Замойского об издании закона относительно порядка избрания королей, равно как и относительно решения дел на сеймах большинством голосов, не встретили поддержки. Замойский потерял свое прежнее влияние, но на военном поприще ему удалось оказать Польше ещё ряд больших услуг. Два похода его в Молдавию (в 1595 и 1600 годах) повели к упрочению влияния Речи Посполитой в этой стране. В 1601 и 1602 годах Замойский участвовал с блестящим успехом в кампании против восставших воевод.
Немало стараний приложил Замойский и для развития наук. Он деятельно помогал Стефану Баторию в приглашении в Польшу известных европейских учёных. Со многими учёными и писателями он находился в сношениях, любил себя окружать ими и оказывал им покровительство. В 1580 году на месте своего родного гнезда Скоковки Замойский основал город Замосць и устроил там в 1594 году академию по образцу итальянских университетов. Процветать она не могла, так как имела мало средств. Католическая реакция, охватившая Польшу в царствование Батория, нашла в лице Замойского сильную опору. Он ввёл иезуитов даже в свой дом, которые обратили вторую жену его Христину (урождённую Радзивилл) из протестантизма в католицизм. Особенно усердную поддержку оказывал Ян Замойский пропаганде католицизма среди православного населения русских земель.